[发明专利]一种基于数字微滴PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用

说明书

本发明公开了一种基于数字微滴PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用，属于病毒分子检测技术领域。本发明所述引物由如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的引物和探针是针对病毒gB基因保守区域设计的特异性引物和探针，特异性好、灵敏度高，尤其适用于检测成分复杂的粪便样本或其他复杂样本，也可适用于检测基质成分复杂的环境样本，在扩增体系为20μL时，最低可检测到为3.3个拷贝的目的基因。

技术领域

本发明涉及病毒分子检测技术领域，特别是涉及一种基于数字微滴PCR检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物探针组合及其应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)，又称“坏死性鼻炎”、“红鼻病”，由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,BoHV-1/IBRV)感染引起的，OIE称为牛传染性鼻气管炎/牛传染性脓疱性阴户阴道炎，被世界动物卫生组织列为必须上报疫病之一，我国将其列为二类传染病。本病最早于1955年在美国的科罗拉多州肉牛中报道。在自然感染条件下，病毒主要感染牛，尤其以肉牛多见，其次是奶牛，临床表现形式多样，以呼吸道为主，伴有结膜炎、流产、乳腺炎，有时诱发小牛脑炎等。感染牛临床主要表现为体温升高，食欲减退和精神沉郁，随后伴有脓性鼻液和眼结膜炎，病毒感染也可导致产奶量下降和流产。急性IBRV呼吸道感染还可以继发细菌性肺炎。此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大影响。在自然交配地区，生殖器感染能导致外阴阴道炎和龟头包皮炎，是造成养牛业经济损失的重要疫病之一。因为IBRV感染后一般发生病毒潜伏，在牛群内长期排毒，所以，鉴定血清学中阳性动物筛查动物感染状态是较为理想的指标。

BoHV-1是带有囊膜的球形病毒病毒粒子直径130nm-180nm，病毒由囊膜衣壳和核心三部分组成核心由蛋白质与双股线状DNA缠绕而成。BoHV-1病毒基因组DNA为双股线性分子。G+C含量为72％。基因组外包有核衣壳，形成正二十面体立体对称结构，外观呈六角形，有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜。BoHV-1对温度很敏感，在37℃经10h有一半病毒失去活性，在56℃经21min可使病毒灭活。病毒在pH4.5～5不稳定，4℃以下病毒较稳定，保存30d感染滴度几乎无变化。在－70℃保存的病毒经过几年仍能保持活力年。病毒对丙酮、酒精和乙醚等脂溶剂敏感，5％NaOH、1％漂白粉、1％酚0.01％HCl₂可使病毒在数秒钟内灭活。BoHV-1病毒只有一个血清型，通过病毒DNA酶切图谱可以区分各亚型或病毒之间的差异。据测BoHV-1基因组可编码大约70个蛋白质，其主要蛋白有gB、gC、gD和gE四个主要糖蛋白及TK基因，结构和功能目前大部分已知。通常情况下鉴定血清学中阳性动物是检查动物感染状态非常有用而且理想的指标，抗体阳性动物可认为是病毒携带动物和潜在的排毒者，国内目前大型养牛场有使用牛传染性鼻气管炎灭活疫苗，或者幼畜通过吸食初乳获得母源抗体，所以依靠血清抗体对疫病筛查需结合具体情况进行分析，最后的临床诊断仍需要病原的检测。IBR是牛场临床常见病，属于多发病，另外BoHV-1感染还会造成免疫抑制，增加了牛继发感染其他病毒或细菌的几率，给养牛业造成综合性影响。牛群中BoHV-1的筛查及疫病的净化对于牛场健康良性发展尤为重要。BoHV-1基因组GC含量平均75％左右，常规PCR方法对的病原检测具有一定局限性。为了及时发现牛群中病毒携带者，尤其是隐性带毒动物，有效控制病毒在牛群中的传播，建立快速、敏感、准确的牛传染性鼻气管炎病毒检测方法十分必要。目前临床上用于检测BoHV-1病毒核酸的方法主要为PCR、实时荧光PCR，依赖于Taqman探针技术的实时荧光PCR虽然具有高特异性和敏感性，但定量准确性易受样本基质及干扰物质的影响，同时其检测下限仍很高，暂时不能检测出微量的病毒。