[发明专利]α-L-鼠李糖苷酶St-rRha具有耐高温和耐甲醇的用途及其应用

说明书

本发明公开了α‑L‑鼠李糖苷酶St‑rRha具有耐高温和耐甲醇的用途及其应用。还公开了利用α‑L‑鼠李糖苷酶St‑rRha制备普鲁宁的方法。将α‑L‑鼠李糖苷酶St‑rRha用于催化柚皮苷制备普鲁宁的过程中，增加了柚皮苷的溶解度，大大提高了柚皮苷的利用率，与其他报道的酶法催化柚皮苷相比，极大地增加了普鲁宁的产量。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及α-L-鼠李糖苷酶St-rRha具有耐高温和耐甲醇的用途及其应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(E.C.3.2.1.40)能够作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α-1连接的糖苷键，特异性降解柚皮苷、芦丁、槲皮苷、橙皮苷、薯蓣皂苷等黄酮苷类、烯萜类天然产物末端的α-L-鼠李糖。目前，α-L-鼠李糖苷酶已被广泛应用于食品加工领域和医学领域，用于柑橘类果汁脱苦，改善葡萄酒的口感和香气，以及制备许多药物和药物前体。由于类黄酮类物质在常温游离状态下的溶解性差，导致其在酶解反应中的底物利用率受到极大地限制，因此，目前大量研究都在研究其不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质，旨在开发出适用于商业化，可以水解各类黄酮类化合物的α-L-鼠李糖苷酶。

柚皮苷难溶于水，常温下溶解度仅为0.1％，这导致其利用率非常低，限制了其药物活性的开发利用。柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下水解脱掉一个L-鼠李糖后得到产物普鲁宁，它是一种二氢黄酮糖苷类化合物，溶解性好，其降低胆固醇、抗氧化及抗病毒等功效远高于柚皮苷，且对组织细胞具有保护作用，因此利用α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷制备普鲁宁具有重要意义。

目前，有研究采用大孔树脂吸附柚皮苷来提高其在水相反应体系中的转化效率，但是其反应时间较长，转化效果并未达到最佳，并且固体载体的一些参数，如疏水性，孔径和粒径的载体，以及基质的分布可能会严重影响酶解过程中反应物和产物的分配；还有研究通过定向进化技术和定点突变技术来提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定，但是该技术具有不可控性和随机性，无法保证酶的突变性能；还有研究通过改变压力条件来诱导酶的热稳定性和温度，提高底物转化率，但压力通常会导致酶变性，并干扰蛋白质的生物分子结构，从而影响酶的活性；研究报道的新型α-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性和耐有机溶剂性能并不能满足现代工业高效生产普鲁宁的需求。

发明内容

基于此，本发明致力于研究一种新型适用于有机相体系制备普鲁宁，并具有良好耐高温性能的α-L-鼠李糖苷酶。

本发明的目的在于提供一种具有耐高温和耐甲醇用途的α-L-鼠李糖苷酶St-rRha。

为实现上述目的，本发明提供α-L-鼠李糖苷酶St-rRha具有耐高温和耐甲醇的用途。

进一步，耐高温是指α-L-鼠李糖苷酶St-rRha在55-75℃下具有催化柚皮苷制备普鲁宁的用途；耐甲醇是指α-L-鼠李糖苷酶St-rRha在甲醇浓度为20-40％下具有催化柚皮苷制备普鲁宁的用途。

进一步，所述用途为利用St-rRha耐高温和耐甲醇的特性催化柚皮苷制备普鲁宁。

本发明还提供一种普鲁宁的制备方法，其特征在于，制备中使用了所述的α-L-鼠李糖苷酶St-rRha。

进一步，包括如下步骤，

S1.将柚皮苷加入10％-40％甲醇-磷酸盐缓冲液中，加热至55-75℃溶解，使柚皮苷浓度为10-200mg/mL；每隔一段时间取样测定柚皮苷的转化率，当转化率趋于平缓时，反应结束；

S2.将权利要求1所述α-L-鼠李糖苷酶St-rRha的发酵酶液加入到上述反应体系中，于pH5.5-6.5，温度为55-75℃，200-300rpm条件下进行反应。

进一步，反应的时间为0.5-30h。