[发明专利]一种用于半胱氨酸和microRNA生物标志物的检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于半胱氨酸和microRNA的金纳米簇(AuNCs)荧光探针检测方法，分别制备适合于两者的DNA@AuNCs，将Cys和miRNA溶液分别加入至DNA@AuNCs荧光探针中，混合均匀。将混合溶液置于36‑38℃金属浴中孵育0.5‑1.5h。测定所得溶液在400～750nm范围内的荧光发射光谱。用荧光法检测不同浓度的Cys和miRNA标准溶液所对应的荧光强度F，以系列Cys和miRNA标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(F‑F0)/F0为纵坐标，绘制浓度‑荧光强度工作曲线，拟合线性回归方程。将含有Cys或miRNA的样品溶液加入荧光探针中，测定其在特定波长下的荧光强度，将强度值代入工作曲线，计算得到Cys或miRNA的浓度。本发明解决了现有方法耗时较长、误差较大、测试方法繁琐等问题，是一种简便、快速、高灵敏度的检测方法。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种半胱氨酸和microRNA含量检测方法。

背景技术

半胱氨酸(Cys)是一种生物体内重要的氨基酸，其对人体正常的生理功能非常重要，参与细胞的还原过程和体内肽和蛋白质的合成，还可以用于氨基酸类解毒药。生物体内Cys的含量异常常与多种疾病的发生和发展密切相关。Cys的缺乏会导致生物体造血功能下降，产生水肿、肝损伤等不良影响，但过量的Cys也会导致多种神经系统疾病的发生，如阿尔茨海默氏病。因此，Cys含量的准确和快速测定对于相关疾病的早期诊断及预后评估非常重要。

MicroRNA(miRNA)是一类包含在生物体内的非编码RNA，通常由20-24个核苷酸组成，在生物体内参与基因表达的调节及多个生理过程的控制，如细胞分化调节、增殖、代谢、凋亡以及免疫等过程。miRNA的异常表达与多种生理功能异常或疾病的发生发展有着密切的联系。当前，多种miRNA已被用于疾病早期诊断的生物标志物，如miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223、miR-801等。在多种癌症病变组织中，均发现不同种miRNA过度表达的现象，如胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等。

当前，已有多种方法应用于Cys和micro RNA的含量测定，如高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学法、质谱法和荧光光谱法等。上述仪器分析法不仅需要昂贵的仪器，还需要复杂的样品前处理及准备工作，而荧光光谱法具有灵敏度高，样品预处理简单等优势，有望应用于实际样品中Cys和micro RNA的快速检测。

发明内容

因此，为了克服现有技术手段中存在的缺点，如测试时间较长、误差较大、测试过程繁琐等问题，本发明要解决的技术问题是，开发一种简便、快速且灵敏度高的生物传感方法，用于半胱氨酸和miRNA的检测。

本发明的技术方案是，

一种用于半胱氨酸的检测的DNA@AuNCs的合成方法，包括DNA@AuNCs的合成：

a、将链长为15-30的聚核苷酸配制成10-200μM的储备液，按照3-4:1-2体积比与HAuCl₄溶液混合，搅拌混匀，得到混合溶液；

b、向混合溶液中加入100-400mM柠檬酸钠溶液，并混合均匀；然后将所得溶液在室温黑暗中放置12-36h以促进AuNCs的形成，得到DNA@AuNCs。

合成后的DNA@AuNCs在使用前存储在4℃下。

根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的DNA@AuNCs的合成方法，优选的是，步骤a所述聚核苷酸溶液和氯金酸溶液的体积比是3-4:1；步骤a所述搅拌为磁力搅拌。优选的是，步骤a所述的氯金酸溶液的浓度是0.5-5mM。

根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的DNA@AuNCs的合成方法，优选的是，步骤b所述柠檬酸钠溶液浓度为100-200mM。

本发明还提供了上述方法得到的DNA@AuNCs体系在Cys定量检测方面的应用，