[发明专利]突变蛋白和羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法

说明书

本发明涉及一种糖基转移酶突变蛋白smRrUGT33，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；本发明还涉及编码糖基转移酶突变蛋白smRrUGT33的编码基因如SEQ ID No.2所示，将其构建到酿酒酵母细胞株中，可表达突变蛋白smRrUGT33。本发明的突变蛋白smRrUGT33催化的特异性强且催化效率高，采用简单的生物合成手段，可实现高效绿色的糖苷类化合物的生产。并且本发明的突变蛋白smRrUGT33的糖供体杂泛性高，催化多种糖供体生成糖苷化合物，可用于大规模生产多种糖苷类化合物。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及糖基转移酶突变蛋白smRrUGT33和羟基酪醇糖苷化衍生物的合成方法。

背景技术

羟基酪醇是一种天然的具有脂溶性、水溶性以及生物活性的多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦苷经过水解后可得到游离的羟基酪醇。羟基酪醇基于多羟基结构，在抗氧化，预防肿瘤等多种领域具有很大的应用前景，例如癌症化学预防、抗动脉粥样硬化、抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性，近年来深受生物和医学界的重视。

糖苷类化合物广泛存在于各种植物体中，分布于植物的根、茎、叶、花和果实中。糖苷的化学结构种类很多，主要有含硫苷、氰醇苷、酚苷类、黄酮苷等。糖基化能够改变小分子化合物的活性、稳定性和溶解性。许多糖苷化合物具有多种生物活性，具有重要的药用价值。例如红景天苷，它存在于植物红景天中，具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种生物活性，在临床上得到广泛应用；羟基红景天苷属于羟基酪醇的葡萄糖苷化物，具有良好的神经保护作用，且对人乳腺癌MCF-7细胞具有抗增殖和凋亡作用；羟基酪醇β-D-吡喃木糖苷也具有良好的神经保护功能，能够有效降低细胞内ROS水平。研究羟基酪醇可通过发展热门药物分子的下游产物，能够拓宽该药物一系列的衍生物库，有助于在药物使用和药品研发方面提供新的思路。

目前获取糖苷化合物主要从植物中提取或者通过化学合成。但是可利用的植物资源逐渐减少，且植物体中糖苷化合物含量较低，从植物中提取的糖苷化合物成本高，工作量大，且产量远不能满足于人们的需要。化学合成法步骤繁琐，催化剂昂贵，收率低，环境污染严重，而且往往残留少量或痕量的其它有毒化学品，具有不安全性。因此急需寻找新的方法来生产糖苷化合物。

2006年，Mao等在微生物中通过生物转化的方式进行糖基化反应，但是糖基化菌株产量及产率都普遍较低(Mao Z,Shin HD,Chen RR.2006.Engineering the E.coli UDP-glucose synthesis pathway for oligosaccharide synthesis.Biotechnol Prog 22(2):369–374.)。2015年，Frederik De Bruyn等人通过在重组大肠杆菌中引入蔗糖代谢途径，并在糖基转移酶UvGT2作用下，成功获得没食子酸糖基化产物没食子酸吡喃葡萄糖(Frederik De Bruyn,Brecht De Paepe,Jo Maertens,Joeri Beaupreze.Development ofan In Vivo Glucosylation Platform by Coupling Production to Growth:Productionof Phenolic Glucosides by a Glycosyltransferase of VitisVinifera.Biotechnology and Bioengineering 112:1594-1603.)。为糖苷化过程提供了一种新思路。

相较于植物提取法和化学合成法，生物合成技术用于药物分子的制备越来越受到关注。生物合成羟基酪醇糖苷化衍生物是利用细菌、真菌等微生物，以葡萄糖或者生物质水解液为碳源，经微生物发酵生产的方法。相较于化学合成的方法，生物合成的最大优势是原料便宜、易得，同时满足环境友好，符合绿色制造的理念。