[发明专利]一种高纯度NK细胞库构建方法

说明书

本发明提供了一种高纯度NK细胞库构建方法，所述的方法包括NK细胞的体外扩增、NK细胞磁珠分选、NK细胞的冻存、NK细胞冻存后扩增培养。本发明的技术方案增强了NK细胞复苏后再次扩增能力，具有应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高纯度NK细胞库构建方法。

背景技术

人自然杀伤细胞(NK)占所有循环淋巴细胞的15％。NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞表现出抗肿瘤细胞毒性，无需事先致敏和产生细胞因子以及调节各种免疫反应的趋化因子。人外周血NK细胞可分为CD3-CD56bright和CD3-CD56dim两大类。CD56bright NK细胞通常被认为是低细胞毒性的细胞因子产生细胞，而CD56dim NK细胞则具有潜在的细胞毒性。由于NK细胞能够识别和分解肿瘤细胞，以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域已经到了一个激动人心的关头。

虽然NK细胞在临床应用上的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的5％-15％，当罹患肿瘤时，大多数肿瘤患者存在体内NK细胞数量下降和/或NK细胞清除癌细胞的能力下降的问题，导致自身的NK细胞分身乏术难以对抗激增的肿瘤细胞，而此时从患者外周血中分离自体NK细胞扩大培养进行过继免疫治疗也难以取得令人满意的效果，这些都为NK细胞的临床应用设置了障碍。NK细胞本身无MHC限制，异体使用不会产生GVHD。但T、B等其他免疫细胞可引发GVHD以及宿主抗移植物等反应。因此，高纯度NK细胞的制备就至关重要。免疫磁珠做细胞分选是高效简捷的免疫细胞的分离纯化方法，MACS(magnetic-activated cell sorting)分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒，磁珠阴性分选可通过微珠标记需要去除的杂细胞，得到高纯度的目的细胞。

为了便于人们有效储存和使用组织和细胞资源，目前在世界范围内已经有多种细胞库或者组织库建立，如脐血造血干细胞库，间充质干细胞库等。建立外周血来源NK细胞库，一方面可以通过多轮扩增提升NK细胞扩增倍数；另一方面，NK细胞库为KIR和HLA配型提供了方便，使得病人可以用到最佳的NK细胞。

NK细胞的增殖潜力有限，体外扩增是一项挑战。近年来对NK细胞扩增培养的研究一般采用添加滋养层细胞培养法和纯因子培养法两种方案。添加滋养层细胞能使NK细胞较好地被激活并大量扩增，但是添加的滋养层细胞即使经过了辐照也仍存在很大的风险，不适合应用于临床；使用纯因子法诱导扩增PBMC中的NK细胞更安全、适用于临床，但扩增倍数一般不理想，另外，异体NK细胞的回输需要完全清除T细胞，以避免GVHD；想要用纯因子法大量扩增并获得纯度大于99％的高活性NK细胞，这无疑是一项极其艰巨的任务。

外周血来源的终末分化NK细胞对于冻存高度敏感，现有的商品化冻存液冻存的NK细胞，按照常规培养手段进行培养，再次扩增能力弱。使得NK细胞库的建立面临巨大挑战。

参考文献：

1.CAR-expressing NK cells for cancer therapy:a newhope.BiosciTrends.2020 Sep 6.

2.Beatriz Cózar et al，Tumor-infiltrating natural killer cells，CancerDiscov.2021 January 01；11(1):34–44.