[发明专利]一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针及其制备方法和试剂盒

说明书

一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针DBCM‑Cys，结构式如下：本发明所述的近红外荧光分子探针仅需两步即可合成，操作简单，在与半胱氨酸反应后，714nm处荧光强度会显著增强，该荧光发射波段为近红外光区，背景干扰少，具有较高的准确性和灵敏度，且具有优异的特异性，不受其他常见的氨基酸和无机盐离子的干扰。

技术领域

本发明涉及一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针及其制备方法和试剂盒，属于有机小分子荧光探针技术领域。

背景技术

半胱氨酸(Cysteine，Cys)是一种重要的小分子生物硫醇，广泛存在于生物系统中，与多种生理和病理活动相关。研究表明，Cys在维持氧化还原平衡的内稳态方面起着关键作用，因此，其水平异常会导致多种疾病的发生。例如缺乏Cys会导致生长缓慢和肝损伤等，而Cys含量过高则会导致阿尔茨海默病等神经病变。因此，在生物系统中实现半胱氨酸的检测具有重要意义。到目前为止，已有紫外-可见吸收分光光度法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)等被开发用于检测Cys。但由于活细胞的胞内环境非常复杂，且这些方法通常需要特殊的仪器设备，并对组织或细胞进行破坏和死后处理，因此并不适合于活细胞等生命系统中Cys的检测。相比之下，荧光分子探针的灵敏度高、特异性强、生物相容性好、且可实现实时无创检测，也已被用于Cys的检测。

如申请号CN201710282924.9、名称为“一种用于检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用”的发明专利申请以萘酰亚胺染料为原料，设计并合成了萘酰亚胺-丙烯酸酯荧光探针，与半胱氨酸反应时能在669nm处发出荧光。

又如申请号CN201710053670.3、名称为“一种以萘酰亚胺为母核的识别半胱氨酸和同型半胱氨酸荧光探针及其制备与应用”的发明专利申请以萘酰亚胺为母核制备识别半胱氨酸和同型半胱氨酸的荧光探针，激发波长为488nm，发射波长为520nm到610nm。

上述文件都是以萘酰亚胺为原料制备的检测Cys的荧光探针，但其波长都不够长，而近红外荧光分子探针(最大发射波长处于700～900nm)具有更好的细胞穿透能力、更小的组织伤害、更低的背景干扰和更低的细胞毒性，更加适用于细胞等生命体系中Cys的检测。因此，开发一种能够检测半胱氨酸的近红外荧光探针是十分重要且有意义的。

发明内容

本发明针对上述问题提出了一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针及其制备方法和试剂盒，所述荧光分子探针能够对半胱氨酸进行特异性检测，且抗干扰能力强。

本发明为解决上述问题所采用的技术手段为：一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针DBCM-Cys，结构式如下：

一种用于检测半胱氨酸的近红外荧光分子探针的制备方法，步骤如下：

(1)将DCM和HBC充分溶解于乙腈溶剂，加入哌啶，氮气或氩气等惰性气体保护下于40～60℃回流反应至结束，减压除去反应溶剂，柱层析纯化得深红色固体产物DBCM；其中DCM与HBC的用量比为：1:0.8～1:1.5mmol/mmol，DCM与溶剂的用量比为：1:8～1:15mmol/mL，DCM与哌啶的用量比为：12:1～7:1mmol/mmol；

(2)在惰性气体保护、0℃下将DBCM溶于无水二氯甲烷中，滴加三乙胺，最后缓慢滴入溶有丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，0℃下搅拌至反应完全，萃取、合并有机层，干燥后浓缩，柱层析纯化后可得目标荧光探针DBCM-Cys；其中DBCM与无水二氯甲烷的用量比为：1:8～1:20mmol/mL，DBCM与三乙胺的用量比为：1.5:1～2.5:1mmol/mL，丙烯酰氯的二氯甲烷溶液浓度为：1:4～1:6mmol/mL，DBCM与丙烯酰氯的用量比为：1:1～1:1.5mmol/mmol。

合成路线如下：