[发明专利]一种丝状真菌通用CRISPR/Cas9编辑系统及其构建方法

说明书

本申请公开了一种丝状真菌通用CRISPR/Cas9编辑系统及其构建方法，属于基因工程领域。本申请方法包括：获取FFH2B定位信号和FF5sRNA启动子的核苷酸序列；以FFH2B为模板设计引物扩增出带有同源臂的FFH2B表达框，并与模板质粒pUC‑Cas9‑HPH的酶切线性片段进行克隆和测序验证，获得重组质粒pUC‑Cas9‑HPH‑FFH2B；以FFN20表达框为模板设计引物扩增出带有同源臂的FFN20表达框，并与模板质粒pUCneo的酶切线性片段进行克隆和测序验证，获得重组质粒pUCneo‑FFN20；将pUC‑Cas9‑HPH‑FFH2B与pUCneo‑FFN20转化到感受态细胞中，即可根据靶标基因进行编辑。本申请的CRISPR/Cas9编辑系统具有通用性和高效性，可以对更多的丝状真菌进行基因编辑。

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，尤其涉及一种丝状真菌通用CRISPR/Cas9编辑系统及其构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是由Cas9核酸酶和sgRNA两个组件构成。其中，基于sgRNA引导的Cas9核酸酶能够与DNA靶位点特异性结合的特点，从而可以根据原型间隔序列设计不同的sgRNA以识别不同的靶DNA，进一步实现基因序列的敲除与插入。

目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被开发并用于不同丝状真菌的相关研究中，并且为解决Cas9蛋白的表达问题，相关技术中公开了可以利用SV40核定位信号(SV40NLS，PKKKRKV)与Cas9蛋白先融合再进入细胞核实施切割的策略；以及为解决sgRNA的表达问题，相关技术中公开了可以利用体外转录或体内转录的方法合成sgRNA。

但是，SV40核定位信号的识别局限性较大，仍有一部分丝状真菌不能有效识别SV40NLS，使得Cas9蛋白不能进入细胞核发挥切割作用；而通过体外转录或体内转录合成sgRNA在实际应用中产生以下缺陷：一是体外转录合成sgRNA只适用于可以制备原生质体的丝状真菌，并且操作繁琐、易降解、成本高；二是体内转录合成sgRNA通常利用细胞自身的RNA聚合酶在体内将sgRNA进行转录表达，由于sgRNA本身没有5’端帽子和3’端多聚A尾巴，使得细胞内无法直接被常用的RNA聚合酶II型(PolII)启动子转录，只能被RNA聚合酶III型(PolIII)启动子转录，极大限制体内转录合成sgRNA。

发明内容

本申请的目的在于提供一种丝状真菌通用CRISPR/Cas9编辑系统及其构建方法，旨在解决现有CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率低以及不能在丝状真菌中通用的技术问题。

为了实现上述目的，本申请的技术方案是：

本申请的第一方面提供一种丝状真菌通用CRISPR/Cas9编辑系统的构建方法，所述方法包括：

获取丝状真菌H2B定位信号和5sRNA启动子的核苷酸序列；

将丝状真菌H2B作为模板设计引物FFH2B-F和FFH2B-R，并PCR扩增出带有同源臂的FFH2B表达框之后，利用内切酶SpeI将模板质粒pUC-Cas9-HPH酶切成线性片段，并将线性片段与所述带有同源臂的FFH2B表达框进行克隆和测序验证，获得重组质粒pUC-Cas9-HPH-FFH2B，其中，所述模板质粒pUC-Cas9-HPH的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；

将丝状真菌N20表达框作为模板设计引物FFN20-F和FFN20-R，并扩增出带有同源臂的FFN20表达框之后，利用内切酶KpnI将模板质粒pUCneo酶切成线性片段，并将线性片段与所述带有同源臂的FFN20表达框进行克隆和测序验证，获得重组质粒pUCneo-FfN20；

将所述重组质粒pUC-Cas9-HPH-FFH2B与所述重组质粒pUCneo-FFN20同时转化到丝状真菌感受态细胞中，即可根据靶标基因进行编辑。

优选的实现方式中，根据NCBI获取所述丝状真菌H2B定位信号和所述5sRNA启动子的核苷酸序列。