[发明专利]一种基于miR-302d骨架的高效率shRNA表达载体及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种基于miR‑302d骨架的高效率shRNA表达载体及其制备和应用。本发明通过降低passenger strand的表达和减少guide strand中非特异性靶向序列的表达，增强特异性靶向序列的表达即提高guide strand的均一性，并对miR‑302d的侧翼序列以及shRNA表达载体的茎环序列进行优化，提高靶向效率、降低脱靶效率，在基因功能研究和基因治疗领域有更广的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于新型microRNA骨架的高效率shRNA表达载体及其制备和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA inference，RNAi)技术的出现为基因沉默以及基因治疗的研究提供了新的技术手段，也为肿瘤学研究提供了新的思维模式和研究方向。通过RNAi的方式靶向相应的基因能够较好的研究基因的功能和几个基因间的联系。RNAi技术可以通过合成的siRNA或者基于质粒的shRNA两类分子来行使功能。

shRNA技术目前面对的问题主要包括：(1)敲低效率不足。根据现有的设计针对GFP基因设计十条shRNA，只有3条shRNA能达到50％以上的敲低效果，存在着敲低效率较低且筛选难度大的问题。(2)缺陷—脱靶效应。shRNA在经过Drosha和Dicer的处理后形成两条RNA单链，一条导向链(Guide strand，具有基因沉默功能的siRNA链)，另一条与之互补配对的过客链(Passenger strand，没有基因沉默功能的siRNA链)也会有较高程度的表达。Passenger strand的表达是造成shRNA的脱靶的主要原因之一。基于现有的研究，shRNA作用的胞内处理机制，shRNA的脱靶主要分为两种形式：一种是shRNA最终通过RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)起作用的guide strand非特异性的阻碍了非目的mRNA的表达；第二，passenger strand的表达所带来脱靶效应。

综上所述，如何提高shRNA的靶向效率及降低脱靶效率为当前shRNA优化的两个重要方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于miR-302d骨架的高效率shRNA表达载体及其制备和应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种RNAi骨架载体，所述RNAi骨架载体基于miR-302d骨架序列。miR-302d可以作为一种passenger strand低表达而guide strand均一高表达miRNA表达载体。并在此载体基础上进一步优化。其中RNAi骨架载体可用于慢病毒，逆转录病毒等表达载体，以及质粒，siRNA等的制备。

优选地，所述miR-302d骨架序列如如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述RNAi骨架载体的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述RNAi骨架载体中的5’端长度为80～23nt。

优选地，所述5’端序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，所述RNAi骨架载体中的3’端长度为133～25nt；更佳为59～29nt。

优选地，所述3’端序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

本发明的第二方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含本发明第一方面所述的RNAi骨架载体。

优选地，所述重组载体还包括shRNA。

优选地，所述重组载体包含茎环结构区域；所述茎环结构区域序列完全互补。

优选地，所述重组载体的茎环结构区域中靶向shRNA的序列片段的长度为21～23nt；优选为22～23nt。