[发明专利]一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体

说明书

本发明公开了一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体，至少包含：(1)目标蛋白编码序列和YebF蛋白编码序列，目标蛋白编码序列与YebF蛋白编码序列通过TEV酶切识别位点编码序列连接；(2)DsbA、DsbC和SecM蛋白编码基因。本发明根据大肠杆菌分泌表达的特点，设计了一个YebF融合标签，可用于引导目的蛋白跨细胞质膜及外膜实现细胞外表达，同时在其C‑末端设置TEV酶的氨基酸识别位点，方便后续目的蛋白的回收与纯化，同时共表达Dsb家族蛋白与SecM蛋白，可以明显提高目标蛋白的分泌表达量。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种促进分泌表达的载体构建及其重组蛋白的表达方法。

背景技术

大肠杆菌的遗传背景研究比较透彻，加之其容易培养，生长速度快，表达载体丰富、大规模培养工艺成熟、表达量高等特点，是应用最广泛的基因工程合成异源蛋白的原核表达系统。重组目的蛋白质高水平表达是工业化生产应用最重要的先决条件之一。

作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌，被内膜(又称质膜)和外膜隔开形成三个腔(compartment)：细胞质、周质和胞外，相应地，在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白可定位于细胞质、周质空间或胞外培养基中。其中Sec途径是大肠杆菌大多数蛋白质分泌至关重要的途径，涉及Sec分泌系统的相关蛋白,由在细菌中相当保守的一些蛋白质组成。

近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽，大小为10.8kDa，虽然其功能未知，但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。

无论在生物体内还是体外进行蛋白质的折叠，二硫键的氧化形成在其折叠形成天然构象过程中发挥的重要作用。大肠杆菌的周质形成一个氧化的环境，其中一类折叠酶(foldases)—Dsb家族蛋白质在蛋白质形成正确的二硫键的过程中发挥关键作用，从而使得大肠杆菌能保证新生多肽链在周质中能够及时并正确地折叠，避免由于蛋白质的错误折叠形成不正确的空间构象被蛋白酶降解，在重组蛋白的过量分泌表达过程中，利用Sec途径中的相关转运蛋白或Dsb家族与二硫键形成有关的辅助蛋白，加速重组蛋白跨细胞质膜分泌并及时形成正确的二硫键，最终提高重组蛋白的分泌表达水平在理论上成为可能。

目前在大肠杆菌中实现重组蛋白跨细胞质膜及外膜的细胞外分泌表达的成功案例较少，且已报道的细胞外分泌表达的水平都较低，离产业化的要求还有较大的距离。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：。

本发明的技术方案为：一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的表达载体，至少包含：

(1)目标蛋白编码序列和YebF蛋白编码序列，目标蛋白编码序列与YebF蛋白编码序列通过TEV酶切识别位点编码序列连接；

(2)DsbA和DsbC蛋白编码基因；

进一步地，还包含SecM编码基因。

进一步地，所述表达载体不含lacI基因。

进一步地，所述YebF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，TEV酶切识别位点的氨基酸序列为ENLYFQ，DsbA蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，DsbC蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述DsbA和DsbC蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

进一步地，所述SecM的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

一种含有上述所述的表达载体的大肠杆菌。

一种促进目标蛋白在大肠杆菌细胞外分泌表达的方法，将目标蛋白与YebF蛋白在大肠杆菌中融合表达，同时共表达DsbA蛋白、DsbC蛋白。