[发明专利]一种固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱柱、制备方法和应用

说明书

本发明一种固定化TwinsStrep‑Tag融合蛋白的线粒体膜色谱柱、制备方法和应用，属于线粒体膜色谱柱制备技术领域。该方法首先将包含半胱氨酸的Strep‑Tactin蛋白键合到硅胶上，取线粒体膜上的TwinsStrep‑tag融合蛋白受体特异性结合上述包含半胱氨酸的Strep‑Tactin蛋白，形成稳定的亲和体系，使Twins Strep‑tag融合蛋白固定在硅胶表面，得到线粒体膜色谱固定相，采用湿法装柱，制得固定化TwinsStrep‑Tag融合蛋白的线粒体膜色谱柱。本发明方法制备的线粒体膜色谱柱可靶向线粒体膜上特定蛋白，从复杂成分中高通量筛选与目标蛋白具有相互作用的小分子化合物。

技术领域

本发明属于线粒体膜色谱柱制备技术领域，具体涉及一种基于Strep-Tactin(含半胱氨酸)的固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的亲和型线粒体膜色谱柱及其制备方法和应用。

背景技术

线粒体膜色谱相对细胞膜色谱法可以更进一步靶向到亚细胞器，降低了其他亚细胞器膜对实验结果的影响，使得药物筛选目的更加明确，机理研究更加清晰，可以从复杂成分中快速筛选出靶向线粒体调节分子。然而现有的关于线粒体膜色谱法的研究较少，且存在一定的问题，主要体现在以下几个方面：第一是制备过程复杂，繁琐、耗时，需要通过复杂设备提取出纯度较高的线粒体；二是特异性较差，线粒体内外膜上存在较多的蛋白靶点，不能指示出所筛选药物具体靶向的线粒体蛋白，机理不明确，这也为后期筛选出的活性成分药理研究带来新的问题；第三是化学键合可能会破坏蛋白结构；第四是仅研究了线粒体膜受体与一些已知阳性药物的结合能力及膜上蛋白的性能，且结合能力差，靠吸附作用并不能维持膜蛋白的稳定性，还不能用于靶向线粒体膜蛋白药物的高通量筛选。

Strep-Tactin重组蛋白与Twins Strep-Tag之间的特异性亲和作用是自然界中最强的非共价作用之一，Twins Strep-Tag是一种由18个氨基酸组成的蛋白融合标签，其分子量小几乎不影响蛋白质天然结构，因Twins Strep-Tag与Strep-Tactin特异性结合是可逆的，所以常用于重组蛋白的纯化利用。本发明将Twins Strep-Tag用于链接线粒体膜与氨基丙基固定相，最大化保持蛋白质生物活性，也解决了线粒体膜与固定基质物理吸附的结合力弱的问题。

因此，基于目前尚无关于Twins Strep-Tag与Strep-Tactin重组蛋白的跨膜蛋白受体固定化技术的报道，为提供高效稳定的线粒体膜色谱固定相，构建了一种基于Strep-Tactin(含半胱氨酸)的固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的亲和型线粒体膜色谱柱制备方法。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于Strep-Tactin(含半胱氨酸)的固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的亲和型线粒体膜色谱柱及其制备方法和应用，该线粒体膜色谱柱稳定性较好，特异性强，制备方法操作简单，易于实现。

本发明首先将4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯键合到氨基丙基硅胶上，作为Strep-Tactin(含半胱氨酸)键合到硅胶上的linker，接下来线粒体膜上的Twins Strep-Tag融合受体即可特异性地与底物发生亲和结合作用，从而使得融合蛋白间接固定在硅胶表面制得线粒体膜固定相。再通过湿法装入色谱柱中，构成一种基于固定化Strep-Tactin融合蛋白的线粒体膜色谱柱。该固定化Strep-Tactin融合蛋白的线粒体膜色谱柱稳定性高，特异性强。解决了现有的线粒体膜色谱柱存在特异性较差的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱固定相，所述线粒体膜色谱固定相是将包含半胱氨酸的Strep-Tactin蛋白键合到硅胶上，取线粒体膜上的Twins Strep-tag融合蛋白受体特异性结合上述包含半胱氨酸的Strep-Tactin蛋白，使Twins Strep-tag融合蛋白固定在硅胶表面，得到线粒体膜色谱固定相。