[发明专利]一种固定化Twins Strep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱柱、制备方法和应用

权利要求书

1.一种固定化TwinsStrep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，所述线粒体膜色谱固定相是将包含半胱氨酸的Strep-Tactin蛋白键合到硅胶上，取线粒体膜上的Twins Strep-tag融合蛋白受体特异性结合上述包含半胱氨酸的Strep-Tactin蛋白，形成稳定的亲和体系，使TwinsStrep-tag融合蛋白固定在硅胶表面，得到线粒体膜色谱固定相。

2.如权利要求1所述的一种固定化TwinsStrep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，所述硅胶为氨基丙基硅胶；所述包含半胱氨酸的Strep-Tactin蛋白通过4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯进行化学反应键合到硅胶上。

3.一种固定化TwinsStrep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱柱，其特征在于，所述线粒体膜色谱柱是将权利要求1所述的基于Strep-Tactin的固定化融合蛋白的线粒体膜色谱固定相采用湿法装柱制得。

4.一种如权利要求1或2所述的固定化TwinsStrep-Tag融合蛋白的线粒体膜色谱固定相的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取氨基丙基硅胶，并使其活化；称取4-二甲氨基吡啶和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶解在干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，获得溶液；

(2)将上述活化后的氨基丙基硅胶加入到上述溶液中，在室温避光下充分搅拌反应，离心后收集沉淀，清洗后干燥，制得4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯修饰的硅胶固定相；

(3)称取含有半胱氨酸的Strep-Tactin用磷酸钾缓冲液清洗后，溶解在磷酸钾缓冲溶液中制备悬液，加入上述4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯修饰的硅胶固定相，避光搅拌，充分反应，制得包含半胱氨酸的Strep-Tactin修饰的硅胶固定相；

(4)培养TwinsStrep-Tag融合蛋白高表达细胞系，当细胞计数不低于10⁷个时，去除培养基，获得TwinsStrep-Tag融合蛋白细胞，分离出线粒体；

(5)超声破碎上述线粒体，制备线粒体膜悬液，将线粒体膜悬液加入到上述步骤(3)得到的包含半胱氨酸的Strep-Tactin修饰的硅胶固定相中，均匀搅拌0.5～1h后，得到以包含半胱氨酸的Strep-Tactin修饰的硅胶为载体的线粒体膜固定相。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化的条件包括：80～120℃烘箱干燥12～24h；所述4-二甲氨基吡啶、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯与活化后的氨基丙基硅胶的加入质量比为12:25:400～12:25:100；

步骤(2)中所述搅拌反应的时间为12～24h。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述含有半胱氨酸的Strep-Tactin与4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯修饰的硅胶固定相的质量比为1:10～2:5；所述避光搅拌的条件为：温度4℃，时间30～40h；磷酸钾缓冲溶液的pH为7.0，浓度为1.3mol/L。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述分离出线粒体的具体步骤包括：将获得的TwinsStrep-Tag融合蛋白细胞用低渗缓冲液混悬后，置于冰上孵育，进行破碎，在线粒体分离介质存在下通过差速离心分离出线粒体。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述低渗缓冲液为10mmol/LTrisbase、10mmol/L氯化钠、2.5mmol/L氯化镁的混合溶液；所述线粒体分离介质为10mmol/LTrisbase、250mmol/L蔗糖、1mmol/LEDTA二钠盐。