[发明专利]一种rhTNK-tPA的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种rhTNK‑tPA的分离纯化方法，该方法包括：将rhTNK‑tPA细胞收获液依次进行Blue Sepharose 6Fast Flow亲和层析、Lysine HyperD亲和层析和Capto S ImpAct离子交换层析。该方法通过三步层析就能分离rhTNK‑tPA且能达到较高的分离纯度，同时大幅度降低原液中宿主细胞蛋白残余量。另外，通过改变洗脱成分来提高纳滤膜的载量，减少纳滤膜使用面积，从而大幅减少纳滤成本。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种rhTNK-tPA的分离纯化方法。

背景技术

重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂(rhTNK-tPA)是采用哺乳动物细胞培养技术表达生产的基因重组蛋白药物，是全新第三代特异性溶栓药物，较第二代溶栓效率更高，全身系统性出血较少，无过敏反应和毒副作用。rhTNK-tPA可常温储存运输，是目前唯一可以单次静脉推注的溶栓药品种，其具有一针救命，使用方便的特点，更加适合急救，使得溶栓治疗在院外进行成为可能。在rhTNK-tPA的生产过程中，纯化工艺对产品的质量有重要影响。

现有技术主要是通过两步亲和层析、一步阴离子层析和一步凝胶层析进行分离纯化。存在层析步骤多、生产操作时间长以及宿主细胞残留蛋白(HCP)去除效果一般等问题。HCP是生物制品的关键质量属性(CQA)，直接影响着生物制品的安全性，有效性和稳定性。通常选择在亲和层析这一步骤中最大限度的降低HCP含量，减轻后续纯化压力。然而部分HCP能够与目的蛋白产生相互作用，或者与填料基质非特异吸附，从而导致在亲和纯化工艺中这些HCP非常难以去除，大量的HCP与目的蛋白一起被洗脱和收集，进而对后续纯化工艺造成非常大的困难，甚至可能导致最终产品HCP的含量无法满足质控标准。如何在不影响收率的前提下，最大限度的在亲和层析步骤降低HCP的含量，是目前生产工艺亟需解决的难题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种rhTNK-tPA的分离纯化方法，该方法通过三步层析就能分离rhTNK-tPA且能达到较高的分离纯度，同时大幅度减低原液中宿主细胞蛋白残余量。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种rhTNK-tPA的分离纯化方法，其包括将rhTNK-tPA细胞收获液从亲和层析柱上洗脱，亲和层析包括Lysine HyperD亲和层析；

上述Lysine HyperD亲和层析的洗脱液的pH为4.0～5.0。

在一些实施例中，Lysine HyperD亲和层析的洗脱液的组分为醋酸盐缓冲液、氨基己酸和尿素中的至少一种。

在一些实施例中，洗脱液中醋酸盐缓冲液的浓度为10～20mM，氨基己酸的浓度为0.1～0.3M，尿素的浓度为2～3M。

在一些实施例中，Lysine HyperD亲和层析在洗脱步骤前还包括稀释、平衡和洗杂。

在一些实施例中，稀释包括将含rhTNK-tPA的收集液用F脲稀释7-9倍，F脲的组分为0.4M尿素、20～100mM磷酸盐缓冲液。

在一些实施例中，Lysine HyperD亲和层析的平衡液的组分为20～100mM磷酸盐缓冲液，pH值为7.0～9.0，用量为柱体积的1.5～3.0倍。

在一些实施例中，Lysine HyperD亲和层析的洗杂液的组分为20～100mM磷酸盐缓冲液和1～2M氯化钠，pH值为7.0～9.0，用量为柱体积的1.5～3.0倍。

在一些实施例中，亲和层析还包括Blue Sepharose 6Fast Flow亲和层析，BlueSepharose 6Fast Flow亲和层析包括平衡、洗杂和洗脱。