[发明专利]一种辅酶再生系统及其制备方法和应用

说明书

本发明提出了一种基于FADHsubgt;2/subgt;依赖的卤代酶和FAD依赖的L‑AAD的双酶级联技术用于FAD/FADHsubgt;2/subgt;再生，构建辅酶再生系统和全细胞生物转化系统，用于从一种底物Trp共同生产7‑Cl‑Trp和IPA。本发明辅酶再生系统包括L‑氨基酸脱氨酶和卤代酶、FAD和/或FADH2。本发明提出的全细胞辅酶再生系统包括可同时表达L‑氨基酸脱氨酶和卤代酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)。与使用两种底物的三酶级联相比，本发明更易于控制和优化以协调反应并获得最大反应速率，使用一种底物有利于降低成本和简化工艺流程。本发明辅酶再生系统和全细胞辅酶再生系统有效且简单的方法，将促进FAD/FADHsubgt;2/subgt;依赖性酶的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅酶再生系统及其制备方法和应用。

背景技术

酶促生物催化是合成许多有价值的化合物和大宗化学品的过程，该工艺相对典型的合成工艺对环境的污染更小，因而酶促生物催化已经成为一种有吸引力的化合物合成替代方法。许多酶促反应需要黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD/FADH₂)，它通常作为电子载体来提供或吸收还原或氧化等价物，但FAD/FADH₂的高成本极大地阻碍了依赖FAD/FADH₂的酶促反应的应用。

可供FAD/FADH₂再生的非酶法包括电化学再生和化学再生。对于电化学再生，人工电极与H₂O₂的形成一起使用，导致电极表面的FAD/FADH₂依赖性酶失活、选择性低和生产率低对于化学再生，此外，酶和有机金属配合物相互失活，导致再生率下降。FAD/FADH₂再生的酶法构建是基于黄素还原酶与醇/甲酸脱氢酶的结合，后者通过催化醇/甲酸氧化为CO₂从NAD+再生NADH，从而产生三酶级联。然而，三酶级联反应的复杂性限制了依赖于FAD/FADH₂的酶的进一步应用以及与其他合成反应的结合。因此，需要更有效和更简单的FAD/FADH₂再生方法。

发明内容

针对上述问题，本发明构建了一种辅酶再生系统及全细胞辅酶再生系统及其制备方法和应用，用于FADH₂依赖的卤代酶和FAD依赖的L-AAD(L-氨基酸脱氨酶)的FAD/FADH₂再生，可从一种底物Trp(色氨酸)共同生产7-Cl-Trp(7-氯-色氨酸)和IPA(异丙醇)，再生过程易于控制和优化，简单高效。

具体的，一方面，本发明辅酶再生系统包括FAD依赖的L-氨基酸脱氨酶(L-ADD)和FADH₂依赖的卤代酶，还包括FAD和/或FADH₂。

在上述技术方案中，本发明辅酶再生系包括了FAD依赖的L-氨基酸脱氨酶和FADH₂依赖的卤代酶，用于FAD/FADH₂再生。如图1所示，卤代酶催化色氨酸的卤化反应生成7-氯-色氨酸(7-Cl-Trp)，广泛应用于制药和农业行业；L-AAD催化L-氨基酸立体定向氧化脱氨基为相应的α-酮酸，广泛应用于制药、食品和化工行业。氧化脱氨基反应为卤化提供了FADH₂，同时卤化反应为氧化脱氨基提供了FAD。本发明辅酶再生系统可基于一种底物Trp来联产7-Cl-Trp和IPA。