[发明专利]一种辅酶再生系统及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种辅酶再生系统，其特征在于，所述辅酶再生系统包括L-氨基酸脱氨酶和卤代酶，还包括FAD和/或FADH₂。

2.根据权利要求1所述的辅酶再生系统，其特征在于，所述辅酶系统还包括单种或多种L-氨基酸；当所述辅酶系统包括单种L-氨基酸时，所述L-氨基酸脱氨酶和卤代酶活性比为1：10～70，优选为1：50～60；当所述辅酶系统种包括多种L-氨基酸时，所述L-氨基酸脱氨酶和卤代酶活性比为1：10～150，优选为1：50～100。

3.一种辅酶再生系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，构建分别表达L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的基因工程菌；经发酵制得含L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的酶液；

S2，对S1所得L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的酶液进行纯化和膜组分分离，得到纯化的L-氨基酸脱氨酶制剂和卤代酶制剂；

S3，将S2所得L-氨基酸脱氨酶制剂和卤代酶制剂混合，并添加FAD和/或FADH₂、L-氨基酸，即得到所述辅酶再生系统。

4.根据权利要求3所述的辅酶再生系统的制备方法，其特征在于，当所述辅酶系统包括单种L-氨基酸时，所述L-氨基酸脱氨酶和卤代酶活性比为1：10～70，优选为1：50～60；当所述辅酶系统种包括多种L-氨基酸时，所述L-氨基酸脱氨酶和卤代酶活性比为1：10～150，优选为1：50～100。

5.一种全细胞辅酶再生系统，其特征在于，包括可同时表达L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)；所述重组大肠杆菌BL21(DE3)转入了表达L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的合成重组质粒pRSFDuet-lsr-laad；所述合成重组质粒pRSFDuet-lsr-laad上表达L-氨基酸脱氨酶基因的重复次数为1～4次，优选为2～3次，更优选为3次。

6.根据权利要求5所述的全细胞辅酶再生系统，其特征在于，所述组大肠杆菌BL21(DE3)中调控L-氨基酸脱氨酶基因表达的RBS序列为TCAAAAACCAACTAGGACCTCAGTACC、AGGAAGTAAGGAGTAACCTAAAGC或TTCAATAAGAGAGCAATTAC，优选为AGGAAGTAAGGAGTAACCTAAAGC。

7.一种全细胞辅酶再生系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，构建整合L-氨基酸脱氨酶基因和卤代酶基因的pRSFDuet-lsr-laad；

S2，将合成重组质粒pRSFDuet-lsr-laad转入大肠杆菌BL21(DE3)中得到同时表达L-氨基酸脱氨酶和卤代酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)；

其中，合成重组质粒pRSFDuet-lsr-laad上表达L-氨基酸脱氨酶基因的重复次数为1～4次，优选为2～3次，更优选为3次。

8.根据权利要求7所述的全细胞辅酶再生系统的制备方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌BL21(DE3)中调控L-氨基酸脱氨酶基因表达的RBS序列为TCAAAAACCAACTAGGACCTCAGTACC、AGGAAGTAAGGAGTAACCTAAAGC、TTCAATAAGAGAGCAATTAC，优选为AGGAAGTAAGGAGTAACCTAAAGC。

9.根据权利要求7所述的全细胞辅酶再生系统的制备方法，其特征在于，还包括对所述全细胞辅酶再生系统进行超声处理，所述超声处理的强度为100瓦～400瓦，优选为200瓦；超声处理的占空比可选为40％～79％，优选为50％；超声处理的作用时间可选为1～4min，优选为2～3min，更优选为2min。

10.权利要求1-3任一项所述的辅酶再生系统、6-8任一项所述的全细胞辅酶再生系统、采用权利要求4-5任一项所述方法制备的辅酶再生系统、采用权利要求9-12任一项所述方法制备的全细胞辅酶再生系统在制药、食品、农业和化工领域的应用。