[发明专利]纯化PEG修饰重组人干扰素β1b蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种纯化PEG单修饰的干扰素β蛋白的方法，更具体而言，涉及一种纯化PEG单修饰的人干扰素β1b蛋白的方法，以及用该方法获得的蛋白纯化产品。所述方法能够实现PEG单修饰的β干扰素蛋白与游离PEG、未修饰的蛋白、多点修饰的蛋白及其他杂质的有效分离，从而获得纯度高、游离PEG残余量低、氰基硼氢化钠残余量低的PEG单修饰蛋白纯化产品。

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，涉及一种稳定、高效地提取PEG修饰重组人干扰素β1b蛋白(IFN-β1b)的方法，更具体而言，涉及作为目标产物的PEG单修饰的IFN-β1b与游离的修饰剂、多修饰或未修饰的蛋白等杂质的分离。

背景技术

β干扰素(IFN-β)是治疗复发缓解型多发性硬化(MS)的一线用药，IFN-β对MS的治疗是基于其免疫调节作用，IFN-β可减少外周血中骨髓树突细胞的数量，还可下调APC的抗原呈递，减少T细胞反应，不仅可降低复发缓解型MS患者的急性发作次数，还能有效延迟复发缓解型和继发缓解型MS患者的病程进展。另外，IFN-β还有较强的抗病毒感染及抗肿瘤作用，临床上对乙型肝炎、丙型肝炎及其病毒性疾病均有明显疗效。干扰素β-1b (IFN-β1b)是将人成纤维细胞来源的IFN-β通过点突变，使Cys17变成Ser17且缺失Met1而得到的基因工程蛋白药物，美国于1993年批准rhIFN-β1b上市，而国内尚无该产品。

聚乙二醇(PEG)偶联药物蛋白后可显著改变其药理和药代性质，由于修饰后聚乙二醇分子可屏蔽药物蛋白的抗原位点，修饰后蛋白可明显降低原型蛋白的免疫原性，此外修饰后的药物蛋白分子量增大，可降低肾小球的滤过作用，修饰后的药物蛋白具有更低的体内清除率，有效提升了原型蛋白和体内半衰期。尤其对于细胞因子类药物，药物在体内半衰期较短，经过聚乙二醇修饰后可明显提高体内半衰期，有效减少药物用量和注射次数。此外，蛋白质通过聚乙二醇修饰后可使其水化半径提高，提升了蛋白质的水溶性，使得一些疏水性较强的蛋白药物提高了稳定性。

干扰素β1b蛋白为强疏水蛋白，因此在该蛋白的制备纯化和聚乙二醇修饰过程中，无法避免使用表面活性剂，目前制备纯化干扰素β1b蛋白缓冲液一般使用十二烷基磺酸钠(SDS)。在十二烷基磺酸钠(SDS)存在下，无法开展离子交换工艺，因为偶联和未偶联PEG的干扰素β1b蛋白均无法结合离子交换填料。而单纯使用凝胶过滤纯化技术，不仅无法去除未偶联蛋白的PEG分子，大量的PEG分子存在影响了凝胶过滤纯化效果，而且单分子PEG修饰的IFN β1b与其它成分无法得到有效分离。通常，PEG修饰过程后得到的蛋白溶液成分复杂，包含未修饰的IFN-β1b原型蛋白、单分子PEG修饰的IFN-β1b蛋白、两个甚至多个PEG分子修饰的IFN-β1b蛋白、以及未偶联的PEG分子。鉴于此，本领域中对于如何将单分子PEG修饰的IFN-β1b蛋白与其他成分有效分离存在需求。

发明内容

本发明提供一种纯化PEG单修饰的IFN-β (PEG-IFN-β)、特别是PEG单修饰的重组人干扰素β1b蛋白(PEG-rhIFN-β1b)的方法，更具体而言，涉及一种稳定、高效地提取经PEG修饰的重组人干扰素β1b蛋白的纯化方法。

本发明的方法所要纯化的经PEG单修饰的IFN-β或重组人干扰素β1b蛋白可以利用PEG修饰剂和氰基硼氢化钠来制备。例如，先准备待修饰的重组人干扰素β1b蛋白(例如，经发酵纯化并复性的重组人干扰素β1b蛋白)；而后使用PEG修饰剂对重组人干扰素β1b蛋白进行修饰；在修饰过程中使用氰基硼氢化钠作为还原剂，对PEG修饰剂进行活化，从而使蛋白的N-端氨基得到充分修饰。但是氰基硼氢化钠属高毒性化合物，需要在后续纯化工艺中逐步去除。

上文所述的PEG修饰剂为PEG的活化形式或活性衍生物，例如，具有N-端氨基反应性的聚乙二醇活化形式(例如甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD))，但不限于此，PEG修饰剂还可以是mPEG-SC (琥珀酰亚胺碳酸酯)、mPEG-SCM (琥珀酰亚胺乙酸酯)、mPEG-SPA (琥珀酰亚胺丙酸酯)、mPEG-OTS (对甲苯磺酸酯)和mPEG丁醛等。