[发明专利]纯化PEG修饰重组人干扰素β1b蛋白的方法

权利要求书

1.一种聚乙二醇PEG单修饰的IFN-β蛋白的纯化方法，所述方法包括以下步骤：

S1) 使用pH为2.5至3.5的洗脱缓冲液对含有PEG单修饰的IFN-β蛋白的混合物进行脱盐凝胶过滤层析，并收集蛋白峰得到第一收集液；

S2) 向步骤S1中得到的第一收集液中添加氯化钠溶液进行盐析，离心分离出沉淀物，并用缓冲液溶解该沉淀物得到复溶液；所述氯化钠溶液中的氯化钠浓度是2.5 M至饱和；

S3) 使用琼脂糖凝胶柱对步骤S2中获得的复溶液进行凝胶过滤层析，收集蛋白峰，得到含有PEG单修饰的IFN-β蛋白的第二收集液；

S4) 采用分子量截留值为30 kDa以下的滤膜过滤浓缩所述第二收集液得到浓缩液；和

S5) 对所述浓缩液进行脱盐凝胶过滤层析，收集蛋白峰得到纯化的PEG单修饰的IFN-β蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述含有PEG单修饰的IFN-β蛋白的混合物是在氰基硼氢化钠的存在下用PEG修饰剂修饰IFN-β蛋白后得到的反应产物混合物。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述PEG修饰剂选自甲氧基聚乙二醇丙醛mPEG-ALD、mPEG-SC、mPEG-SCM、mPEG-SPA、mPEG-OTS和mPEG丁醛。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S1中的洗脱缓冲液为柠檬酸缓冲液。

5. 如权利要求1所述的方法，其中，在步骤S2中，所述氯化钠溶液中的氯化钠浓度是3M至4 M，和/或所述氯化钠溶液的体积是第一收集液的体积0.5至1.5倍。

6. 如权利要求1所述的方法，其中，在步骤S2中，所述氯化钠溶液中的氯化钠浓度是3M至3.5 M，和/或所述氯化钠溶液的体积是第一收集液的体积0.8至1.2倍。

7.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S3使用的所述琼脂糖凝胶柱是SUPEROSE系列。

8.如权利要求1所述的方法，其中，以第二收集液中所用的缓冲液的OD₂₈₀为基线，步骤S4中的所述浓缩进行至浓缩液的OD₂₈₀大于1.100AU。

9.如权利要求1所述的方法，其中，以第二收集液中所用的缓冲液的OD₂₈₀为基线，步骤S4中的所述浓缩进行至浓缩液的OD₂₈₀大于1.200AU。

10.如权利要求1所述的方法，其中，以第二收集液中所用的缓冲液的OD₂₈₀为基线，步骤S4中的所述浓缩进行至浓缩液的OD₂₈₀大于1.300AU。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述IFN-β蛋白是人天然IFN-β蛋白或人IFN-β1b蛋白。

12.用权利要求1至11中任一项所述的方法制得的PEG单修饰的IFN-β蛋白产品，其中，

所述PEG单修饰的IFN-β蛋白的分子量为30至50 kDa；

所述蛋白产品中的PEG残余含量为0.2w/v%以下；

所述蛋白产品中的氰基硼氢化钠含量为0.050 mmol/L以下；并且

所述蛋白产品中的PEG单修饰的IFN-β蛋白的HPLC纯度为95%以上。

13.如权利要求12所述的PEG单修饰的IFN-β蛋白产品，其中，

所述PEG单修饰的IFN-β蛋白的分子量为38至40 kDa；

所述蛋白产品中的PEG残余含量为0.18 w/v%以下；

所述蛋白产品中的氰基硼氢化钠含量为0.0475 mmol/L以下；并且

所述蛋白产品中的PEG单修饰的IFN-β蛋白的HPLC纯度为98%以上。

14.如权利要求12所述的PEG单修饰的IFN-β蛋白产品，其中，

所述PEG单修饰的IFN-β蛋白的分子量为39 kDa；

所述蛋白产品中的PEG残余含量为0.15 w/v%以下；

所述蛋白产品中的氰基硼氢化钠含量为0.0475 mmol/L以下；并且

所述蛋白产品中的PEG单修饰的IFN-β蛋白的HPLC纯度为99%以上。