[发明专利]一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种套膜海葵多肽毒素Ed79‑WR及其制备方法和应用，其氨基酸序列为ACRDTYFASSC(Acm)KAAVDGDRC(tBu)RKSNYKTGC(Acm)AKT C(tBu)GYCT。本发明通过采用多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽Ed79‑WR，对线性肽进行纯化，然后通过定点氧化后获得含有三个二硫键的氧化肽Ed79‑WR(二硫键的连接方式为C1‑C6，C2‑C4，C3‑C5)，并对氧化折叠后的产物进行制备液相纯化、高效液相分析和质谱鉴定，得到套膜海葵多肽Ed79‑WR。本发明将合成的氧化肽Ed79‑WR通过致死性实验测试对草地夜蛾的杀虫作用，本发明套膜海葵多肽毒素Ed79‑WR可应用制备杀虫剂。

技术领域

本发明属于多肽相关技术领域，特别涉及一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR及其制备方法和应用。

背景技术

海葵属于刺胞动物门，是现存最古老的有毒动物之一。海葵具有丰富的药理和生物技术价值，是海洋药物资源库，含有功能复杂多样的肽神经毒素。海洋生物毒素是海洋活性物质中研究发展最迅速的领域之一，也是海洋新型药物研究的热点。一些海洋生物毒素已被应用于神经科学研究工具或直接开发为海洋药物。

现代药理学研究表明海葵毒素具有杀虫、降糖、抗肿瘤、抗菌、降压、镇痛和中枢神经抑制等作用。基于前期对套膜海葵转录组数据的分析，从研究较广泛的ShK家族中筛选出多肽序列，并通过定点氧化法合成具有三个二硫键的海葵功能多肽。通过杀虫实验阐明该海葵多肽具有一定杀虫活性基础。为开发新型杀虫剂，为开发新型海洋药物奠定基础，为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。

发明内容

本研究利用高通量转录组从套膜海葵(Exaiptasia diaphana)中发现套膜海葵多肽毒素Ed79-WR，具有六个半胱氨酸，形成三个二硫键，其氨基酸序列为ACRDTYFASSC(Acm)KAAVDGDRC(tBu)RKSNYKTGC(Acm)AKTC(tBu)GY CT。

本发明提供一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR及其制备方法和应用，该方法制备的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR具有高效杀虫效果，为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR，具有六个半胱氨酸，形成三个二硫键，其氨基酸序列为ACRDTYFASSC(Acm)KAAVDGDRC(tBu)RKSNYKTGC(Acm)AKTC(tBu)GYCT，二硫键的连接方式为C1-C6，C2-C4，C3-C5。

一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取树脂，先用DCM浸泡，然后依次用DMF和DCM洗涤，加入Fmoc-Ala(tbu)-OH、DCM和DIEA进行反应，再加入甲醇和DCM反应，用DMF洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用DMF洗涤，得到第一个树脂；

(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc-Cys-OH和缩合剂，再加入DMF和DIC反应，用DMF洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用DMF洗涤，得到第二个树脂；

(3)根据上述氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；

(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；

(5)用HPLC分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽Ed79-WR；

(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇-水的混合溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；

(7)再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；