[发明专利]一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种套膜海葵多肽毒素Ed79-WR，其特征在于，其序列为ACRDTYFASSC(Acm)KAAVDGDRC(tBu)RKSNYKTGC(Acm)AKTC(tBu)GYCT，具有六个半胱氨酸，形成三个二硫键，二硫键的连接方式为C1-C6，C2-C4，C3-C5。

2.根据权利要求1所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)称取树脂，先用DCM浸泡，然后依次用DMF和DCM洗涤，加入Fmoc-Ala(tbu)-OH、DCM和DIEA进行反应，再加入甲醇和DCM反应，用DMF洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用哌啶-DMF溶液洗涤，得到第一个树脂；

(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc-Cys-OH和1-羟基苯并三唑，再加入DMF和DIC反应，用DMF洗涤，再加入吡啶溶液反应，再用哌啶-DMF溶液洗涤，得到第二个树脂；

(3)根据权利要求1所述的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；

(4)向步骤(3)的线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；

(5)用HPLC分离纯化步骤(4)的多肽粗品，洗脱得到纯品线性肽Ed79-WR；

(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇-水的混合溶液中，再用乙酸稀释，得到乙酸混合溶液，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；

(7)再加入盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；

(8)用HPLC分离纯化后冷冻干燥，得到冻干后的粉末；

(9)将冻干后的粉末溶于TFA-DMSO-苯甲醚溶液中，室温搅拌，再加入TFA-DMSO-苯甲醚溶液，在水浴锅中搅拌；

(10)加入冰乙醚，离心后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；

(11)用HPLC分离纯化步骤(10)的多肽粗品，得到纯品氧化肽Ed79-WR。

3.根据权利要求2所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，步骤(1)反应体系中，所述树脂的取代度Sd＝0.2～1.4mmol/g，按比例加入0.6～1.0mmol Fmoc-Ala(tbu)-OH、10～15mL DCM和1～3mL DIEA进行反应80～100min，再加入3～5mL甲醇和8～12mL DCM反应25～35min。

4.根据权利要求2所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应体系中，在步骤(1)得到的第一个树脂中，按比例加入1.5～2.0mmol氨基酸Fmoc-Cys-OH和1.5～2.0mmol 1-羟基苯并三唑，倒入5～15mL DMF，再加入1～3mL DIC反应0.5～1.5h。

5.根据权利要求2所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，按质量百分比计，所述切割液由95％TFA、1％H₂O、2％EDT和2％TIS制得；步骤(4)、步骤(10)中，所述离心条件为于3～5℃、11000～13000r/min离心4～6min，重复离心2～4次。

6.根据权利要求2所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述甲醇-水的混合溶液中甲醇和水的体积比为1：0.8～1.2，所述乙酸与甲醇-水的混合溶液的体积比例为8.5～9.5：1，每毫升乙酸混合溶液中含有肽0.8～1.2mg；所述甲醇碘溶液的浓度为9～11mg/mL，每毫克肽滴加甲醇碘溶液9～11μL，所述搅拌时间为0.5～2min。

7.根据权利要求2所述的套膜海葵多肽毒素Ed79-WR的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述盐酸-甲醇溶液由45～55mM HCl和甲醇按照体积比1：0.8～1.2制得；所述甲醇碘溶液的浓度为8～12mg/mL，每毫克肽加入甲醇碘溶液0.15～0.25mL。