[发明专利]一种RPA-Cas12a一锅法检测系统及其应用

说明书

本发明公开了一种RPA‑Cas12a一锅法快速检测系统及其应用，该系统包括RPA预混液和CRISPR‑Cas12a预混液；CRISPR‑Cas12a预混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；crRNA为基于次优PAM序列设计的能引导Cas12a靶向识别AHPND RPA产物的特异性向导RNA序列。本发明设计了特异性crRNA，降低Cas12a的切割效率，使RPA扩增过程与CRISPR‑Cas12a特异性切割过程同时在一管中反应，避免了两步法中转移RPA扩增产物潜在的污染风险及繁琐步骤，灵敏度高、稳定性好，为水产养殖业提供了高灵敏度、高准确性、稳定性好、简便快捷的AHPND现场检测方法。

技术领域

本发明属于重要水产病害现场快检，具体涉及一种RPA-Cas12a一锅法检测系统及其应用。

背景技术

急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是对虾养殖中最严重的传染病之一。该疾病起病快、传染性强、死亡率高，已给养殖业造成巨大的经济损失。由于目前还没有有效的治疗方法，早期诊断是降低经济损失的根本方法。AHPND的传统诊断方法包括疾病相关症状分析和组织病理学特征分析。这些方法通常是费力的，耗时的，而且诊断结果不明确，需要依赖专业的操作人员。现代分子技术的应用使AHPND的诊断只需几个小时即可完成，极大地提高了检测效率。这些分子诊断方法都基于PCR，包括PCR、qPCR和巢式PCR，其中巢式PCR是AHPND分子诊断的金标准。然而这些基于PCR的分析不能满足即时检测(Point-of-care testing，POCT)的需求，因为它们需要依赖实验室的热循环设备，往往不能满足现场检测需求。随着技术的不断发展，等温扩增技术应运而生，基于环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等已成功应用于AHPND诊断，具有POCT目的。然而，由于发展年限尚浅，当前的等温扩增技术并没有PCR技术稳定，容易受到环境中多种因素的干扰。如LAMP反应条件等温，扩增效率高，但假阳性信号概率高；与LAMP相比，RPA具有更方便的等温条件(25-42°C)，与荧光探针或横向流动试纸(LFD)结合时，可轻松应用于POCT，然而，基于RPA的侧向流试纸条法和荧光法都需要使用昂贵的特异性探针，检测成本高，反应信号来源于探针的切割，体系复杂，不稳定。将等温扩增技术与CRISPR系统结合是解决这种困难的良好方法。在等温扩增步骤的基础上增加一步CRISPR-Cas蛋白的识别步骤，可以提高检测的准确性和灵敏度。基于此原理，将RPA技术与CRISPR-Cas12a系统组合，已成功开发了DETECTR检测技术，且该技术已广泛应用于多种检测方法的开发。基于DETECTR的检测方法准确可靠，现有技术中公开了一种RPA-Cas12a检测系统(中国申请号2022108198227)，然而，这种RPA扩增与CRISPR切割步骤分开的两步法需要扩增子转移步骤，操作不太便利，转移步骤有污染的风险。因此开发更便捷的RPA-CRISPR一锅法快速检测虾急性肝胰腺坏死病具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对现有检测技术将RPA与CRISPR/Cas12a联合用于AHPND诊断的两步法操作不适用于POCT且存在污染的风险，本发明提供了一种RPA-Cas12a一锅法检测系统，本发明利用基于次优原间隔相邻基元(suboptimal protospacer adjacent motifs，sPAM)设计的特殊crRNA并首次运用于肝胰腺坏死病系统，成功开发了一种RPA-CRISPR一锅法检测系统，将RPA扩增和CRISPR/Cas12a切割整合到同步反应中，克服了RPA扩增和Cas12a切割在一个反应管中的不兼容性问题(图1)。整个检测过程，只需要一次加样步骤，避免了扩增子转移过程中潜在的污染问题，简化了操作步骤，同时检测灵敏度显著提高。本发明为具有POCT目的AHPND诊断提供了新的选择，为开发RPA-CRISPR一锅分子诊断方法提供了良好的借鉴。

本发明还提供了RPA-Cas12a一锅法检测系统在重要水产养殖传染病肝胰腺坏死病的快速现场检测中的应用。