[发明专利]一种RPA-Cas12a一锅法检测系统及其应用在审
| 申请号： | 202310288775.2 | 申请日： | 2023-03-22 |
| 公开（公告）号： | CN116144814A | 公开（公告）日： | 2023-05-23 |
| 发明（设计）人： | 黄和;王佩;杨莎;林蕾;张幸;李昺之 | 申请（专利权）人： | 南京师范大学 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/6844;C12R1/63 |
| 代理公司： | 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 孙斌 |
| 地址： | 210024 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 rpa cas12a 一锅 检测 系统 及其 应用 | ||
1.一种RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，包括RPA预混液和CRISPR-Cas12a预混液；所述RPA预混液包括用于扩增RPA产物的正向引物RPA-F和反向引物RPA-R；所述CRISPR-Cas12a预混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；所述ssDNA为两端分别修饰有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1的单链DNA；crRNA为基于次优PAM序列设计的能引导Cas12a靶向识别AHPND RPA产物的特异性向导RNA序列。
2.根据权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述RPA-F的序列为CATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAAT；所述RPA-R的序列为TAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGC。
3.根据权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述ssDNA的序列为5’FAM-TTATT-3’BHQ1。
4.根据权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述crRNA序列优选为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUUAAUGUCUUGAAUUUUAUC。
5.根据权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述RPA预混液中还包括RPA Buffer A和DEPC水；所述RPA-Cas12a一锅法检测系统中还包括RPA Buffer B。
6.根据权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a预混液包括LbCas12a、10X NEB Buffer 2.1、crRNA和荧光分子ssDNA-FQ。
7.一种权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统在重要水产养殖传染病肝胰腺坏死病的快速现场检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述快速现场检测的方法为：将RPA预混液、Cas12a预混液和模板DNA加入RPA Buffer B混合在实时荧光定量PCR仪中进行一锅反应，进行荧光定量PCR，反应过程中采集FAM荧光信号，终点信号在紫外线下可见，并拍摄图像。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述模板DNA为含或者不含AHPND毒力基因pirB上一段区别于其他物种的保守序列的模板DNA。
10.一种权利要求1所述的RPA-Cas12a一锅法检测系统在制备重要水产养殖传染病肝胰腺坏死病的快速现场检测试剂盒中的应用。
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