[发明专利]一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用

说明书

本发明涉及生物化学和分子免疫学技术领域，具体是一种梣酮‑血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。本申请基于免疫化学法，选择高免疫原性的血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，与梣酮(FRA)化学合成免疫原，将免疫原接种于新西兰大白兔使其产生可以特异性识别梣酮‑蛋白加合物的多克隆抗体。该抗体可以特异性识别蛋白加合物中FRA‑pyrroline和FRA‑pyrrole结构，利用该抗体可对诱发肝损伤的蛋白靶点进行ELISA、Westernblot和免疫荧光检测，为白鲜皮及FRA代谢活化后形成的中间体共价修饰的蛋白质的定性、半定量和可视化定位提供有力的研究工具。

技术领域

本发明涉及生物化学和分子免疫学技术领域，具体是一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。

背景技术

白鲜皮为芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.的干燥根皮。具有清热燥湿，祛风解毒之功效，现代药理作用研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、止血、抗氧化等活性。特别是在治疗皮肤病方面具有显著疗效。随着白鲜皮药材及相关制剂的应用，肝毒性相关的报道逐渐增加，近年来其诱导的药物性肝损伤虽然已经引起关注，但具体的致毒机制仍不清楚。

梣酮(FRA)是白鲜皮药材中的特征性成分，作为其含量测定的控制指标被收载于《中国药典》(2020版)。研究发现白鲜皮中梣酮可诱导小鼠和斑马鱼肝损伤，给以CYP3A选择性抑制剂酮康唑和亲核性试剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)共同处理可显著改善小鼠肝损伤。梣酮是呋喃萜类化合物，根据对呋喃和含呋喃结构的天然化学成分的报道，这些化合物诱导的肝毒性主要与呋喃环的代谢有关。呋喃环经P450酶催化代谢为顺稀二醛(cis-enedial)中间体，是一种强亲电试剂，可迅速与蛋白质上的半胱氨酸(Cys)和/或赖氨酸(Lys)发生共价结合形成吡咯啉(Pyrroline)或吡咯(Pyrrole)结构的加合物，故这些蛋白质加合物的形成被认为是毒性作用的一个重要触发因素。当共价结合发生后，蛋白质的原有功能可能会降低甚至失活，进一步影响肝细胞正常功能甚至引起细胞死亡，最终导致肝损伤，因此被共价修饰的蛋白质的识别与检测具有重要意义。

因此，寻找一种可特异性识别蛋白加合物中FRA-pyrroline和FRA-pyrrole结构的抗体，是目前急需解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种梣酮-血蓝蛋白免疫原及其多克隆抗体与制备方法、应用。

一种梣酮-血蓝蛋白免疫原，是选择高免疫原性的血蓝蛋白(KLH)作为载体蛋白，与梣酮(FRA)化学合成得到。

进一步的，所述梣酮-血蓝蛋白免疫原，是通过如下方法制备得到：取梣酮，加入丙酮，充分溶解后，再加入DMDO，室温搅拌反应，37℃下N₂流吹干，残渣加入Native KLH溶液，常温搅拌反应1，即得免疫原FRA-KLH。

进一步的，所述步骤具体如下：精密称取梣酮7.3mg，加入丙酮750μL，充分溶解后，再加入DMDO 1.5mL，室温搅拌反应30min，37℃下N₂流吹干，残渣加入Native KLH溶液1.48mL，常温搅拌反应1h，即得免疫原FRA-KLH。

一种选择性识别梣酮-蛋白共价结合物的多克隆抗体，采用所述的免疫原免疫动物后制备得到。

进一步的，所述免疫动物后制备得到，是对家兔进行免疫接种后分离血清得到。