[发明专利]基于HRM检测幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药基因的引物及方法

说明书

本发明公开了一种基于HRM检测幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药基因的引物及方法，所述引物组合包括六条引物，HPporD‑HRM‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，HPporD‑HRM‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，HPoorD112‑HRM‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，HPoorD112‑HRM‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，HPoorD335‑HRM‑F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，HPoorD335‑HRM‑R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。本发明提供用于幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药检测的HRM扩增的引物，该引物能够准确判断HP呋喃唑酮耐药，具备很高的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及到分子生物学领域，特别是涉及到检测幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药的高分辨溶解曲线的方法和引物。

背景技术

自从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)1982年被发现以来，其与胃部各种疾病的关系被逐步证实，比如胃炎、胃溃疡、微粘膜组织相关淋巴瘤(MALT)和胃癌，随之被世界卫生组织癌症研究机构定义为第Ⅰ类致癌因子。关于幽门螺杆菌的研究在全世界范围内掀起了一片热潮。我国幽门螺杆菌平均感染率超过50％，并且我国胃癌发病率和死亡率占全球总数的一半。据统计显示，90％以上的胃癌患者是幽门螺杆菌感染者。全球共识认为预防胃部疾病和胃癌的发生的关键是根除幽门螺杆菌。我国也非常重视幽门螺杆菌的防治，并发布了六次《全国幽门螺杆菌感染共识报告》，目前主要为四联疗法，铋剂、质子泵抑制剂，还有两种抗生素。共识所推荐方案中，抗生素有6种，形成了7种组合。其中包含呋喃唑酮的方案有两种。由于7种组合不分先后，根据具体耐药情况使用，因此呋喃唑酮比之前显得更为重要了。近年来，我国幽门螺杆菌的根治成功率不断下降，这主要是由于抗生素的日益耐药导致的。特别是在之前的主流经验治疗方案中的甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星耐药以后，含呋喃唑酮的方案成为了一种重要的补救方案。

呋喃唑酮的耐药性在全国范围内不同，并且有逐年上升的趋势。根据文献报道，其耐药率在上海地区高达40％，在镇江地区为8.7％，而在石家庄却未发现耐药。因此，在治疗幽门螺杆菌时候，检测呋喃唑酮耐药性非常重要。呋喃唑酮为硝基呋喃类抗生素，作用机制与甲硝唑类似，通过5-硝基的氧化还原来杀菌。但是大量的研究显示呋喃唑酮的耐药机制与甲硝唑不同，不是rdxA，frxA和fdxB引起的，而是由于porD和oorD突变导致的，这两个基因主要编码铁氧化还原蛋白。其中porD的突变主要为G343A、A346G和C347G，oorD的突变为A112G和A335G。随着呋喃唑酮耐药率的不断上升，迫切需要一种快速检测耐药的方法。

目前用于呋喃唑酮耐药检测的金标准是幽门螺杆菌分离培养和药敏试验，但是由于HP分离培养困难，对实验室和操作人员要求高，分离率低，所以难以在实际工作中开展。对于耐药突变检测最常用的技术是探针法实时荧光PCR，但是因为呋喃唑酮有两个基因三处突变，并且有多种突变方式，所以需要设计多条探针，比较繁琐。其他方法，比如二代测序等对临床实际样本检测的灵敏度会大大降低，因此也不能够用于检测呋喃唑酮耐药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种基于HRM检测幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药基因的特异性引物及方法。

本发明的技术方案为：一种基于PCR-HRM检测幽门螺杆菌呋喃唑酮耐药基因的引物组合，所述引物组合包括六条引物，分别为HPporD-HRM-F、HPporD-HRM-R、HPoorD112-HRM-F、HPoorD112-HRM-R、HPoorD335-HRM-F、HPoorD335-HRM-R；其中，HPporD-HRM-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，HPporD-HRM-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，HPoorD112-HRM-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，HPoorD112-HRM-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，HPoorD335-HRM-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，HPoorD335-HRM-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。