[发明专利]CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰系统及植物基因组表观编辑系统

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及新的CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰系统及植物基因组表观编辑系统。本发明要解决的技术问题是构建适用于植物的紧凑型CRISPR‑CasФ植物基因组定向编辑系统，使其能在植物中实现基因组定向修饰。本发明的技术方案是一种新的CasФ核酸酶的编码基因，以及基于该基因构建的植物基因组定向修饰系统。基于紧凑型CasФ的基因定向修饰工具可以针对植物进行简单、快捷、高效的基因组定向敲除编辑、基因定向激活和定向表观编辑，在植物基因组敲除编辑和调控方面，尤其是表观编辑调控方面，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及新的CasФ编码基因、紧凑型植物基因组定向修饰系统及植物基因组表观编辑系统。

背景技术

基因组定向编辑技术是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行缺失、置换、敲入或核苷酸修正等方式来实现基因组精确定向编辑。2012年报道的CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated 9)系统，因其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势而被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制及遗传改良中。继CRISPR-Cas9(PAM：5’-NGG-3’)系统之后，研究者发展了新的V-A型CRISPR-Cas系统，CRISPR-Cas12a(PAM：5’-TTTV-3’)。然而，现有CRISPR-Cas9、Cas12a核酸酶尺寸较大(1000Aa)，使它们面临递送困难、PAM识别有限的问题。因此，进一步开发识别多样化PAM、尺寸较小的紧凑型Cas核酸酶基因组编辑系统，可以有效提升编辑工具递送效率，进而扩宽植物基因组编辑工具应用范围，。

最近，研究者报道了一种存在于巨大噬菌体中的V-J型紧凑型CRISPR-CasФ核酸酶系统(Pausch etal.,2020)。该CRISPR-CasФ系统包含一个约700氨基酸编码的核酸酶蛋白和一个CRISPR阵列，可以实现单crRNA(CRISPR RNA)引导的DNA切割。CRISPR-CasФ分子量只有Cas9和Cas12a基因组编辑酶的一半，为基因组编辑工具递送提供了优势。然而，目前CRISPR-CasФ仅显示了在哺乳动物细胞中的编辑活性，而在植物中尚未实现有效的基因组编辑工具开发(拟南芥原生质体中仅在一个位点检测到0.85％的编辑数据)，编辑活性低。因此，CRISPR-CasФ系统在植物基因组编辑中的应用前景仍不明朗。

由于Cas9、Cas12a的蛋白尺寸较大大、递送困难，很大程度上限制了基于此的植物基因组编辑工具应用范围。因此，开发新的紧凑型植物基因组CRISPR-Cas编辑系统具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是构建适用于植物的紧凑型CRISPR-CasФ植物基因组定向编辑系统，使其能在植物中实现基因组定向修饰。

本发明首先提供了一种编码CasФ核酸酶的编码基因。其编码氨基酸序列如SeqID No.12(nCasФ)所述的CasФ核酸酶。

其中，上述的CasФ核酸酶编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.07所示。

在使用中，上述的CasФ核酸酶编码基因可以与转录激活元件的编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ系统的构建。

进一步的，所述的转录激活元件为TAL-VP128、VP64、2xTAD、2xTAD-VP64或VPR等转录激活结构域中的至少一种。

此外，上述的CasФ核酸酶编码基因还可以与甲基转移酶编码基因相连接。两者组合得到的元件可用于构建定向转录激活的CRISPR-CasФ系统。