[发明专利]一种体液中高密度低丰度蛋白的检测方法

权利要求书

1.一种体液中高密度低丰度蛋白的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

S1）材料活化：利用活化剂对纳米级分子筛进行活化处理10-20min，所述活化剂包括按照重量百分数计的如下组分：乙腈0-20%、甲醇60-80%、乙醇0-30%、水0-40%；所述活化剂与纳米分子筛的质量比为10-6000:1；

S2）材料悬浊：将经过S1步骤处理过的纳米级分子筛加入第一缓冲液中，震荡形成悬浊液；所述纳米分子筛与第一缓冲液的质量比为1:1-100；

S3）检测样本孵育：将待检测的体液样本加入步骤S2得到的悬浊液中，混合均匀后在37±1℃的温度下震荡孵育5-30min，得到孵育液；所述体液样本与悬浊液的体积比为：V体液样本：V悬浊液=1:2-50；

S4）蛋白洗脱与酶解：将步骤S3得到的孵育液离心5-45min，弃上清，取沉淀物，将所述沉淀物加入第二缓冲液中并在90±5℃震荡孵育10-30min，所述沉淀物与第二缓冲液的质量比为1:2-50；然后加入胰蛋白酶在28-40℃的温度下酶解1-3h，然后再次加入胰蛋白酶在30-40℃的温度下酶解1-3h，接着加入甲酸或乙酸终止酶解，得到酶解液；

S5）前处理：将步骤S4得到的酶解液依次进行除盐和抽干处理，得到抽干肽段；

S6）检测：将步骤S5得到的抽干肽段复溶，然后进行LC-MS蛋白质谱检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述S1步骤中的纳米级分子筛为FAU、EMT、CHA、MOR、MFI、LTL、LTA和FER纳米分子筛中的一种或两种以上的组合，所述纳米分子筛的粒径为5~1000 nm。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述纳米分子筛的硅铝比为1：1-2000。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的第一缓冲液包括：0-50mmol/L的尿素、0-30mmol/L的Tris-HCl、0-200mmol/L的柠檬酸钠、1-10mmol/L的EDTA、100-300mmol/L的KCl、100-500mmol/L的NaCl、以及按照重量百分数计0-5% 的CHAPS、余量为质谱级水，所述第一缓冲液的pH值=6-8。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述纳米分子筛的硅铝比为1：1-2000。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中采用在离心力5000-10000g的情况下离心5-20min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中的第二缓冲液包括按摩尔体积比计的10-400mmol/L的DTT、10-40 mmol/L的IAA，以及水和NH₄HCO₃，所述水的质量为m1，所述NH₄HCO₃的重量为m₂，m₁：m₂：=90-99：:1-10，所述第二缓冲液的pH值=7-9。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中，对沉淀物加入第二缓冲液后震荡孵育后、在加入胰蛋白酶进行酶解前，对沉淀物中的蛋白质含量进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在步骤S4中，进行酶解所加入的胰蛋白酶与沉淀物中的蛋白质的重量比为1:30-100。

10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S5中采用C18柱对酶解液进行除盐处理。