[发明专利]一种用于改进微生物产生月桂烯的月桂烯合酶变体

说明书

本发明公开了一种月桂烯合酶的变体，属于生物技术领域。所述月桂烯合酶变体基于SEQ ID NO.17所示的野生月桂烯合酶trCsMS序列，包括至少一个以下位点中的氨基酸突变：P22，R43，N102，N106，K140，L423，D471，N481，E523。所述月桂烯合酶变体的核苷酸分子的序列为SEQ ID NO.9～16中所示任意一组核苷酸序列。本发明提供的月桂烯合酶的变体相较野生型表现更好，能够提高微生物合成月桂烯的产量，具有良好的实际应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于改进微生物产生月桂烯的月桂烯合酶变体。

背景技术

月桂烯是一种天然存在于植物精油中的开环单萜，是重要的工业原料，可作为多种高价值合成香料的前体，还可用来合成维生素E；此外，月桂烯聚合活性高，可以聚合形成性能优良的橡胶材料，具有重要的应用价值。

虽然月桂烯存在于植物精油中，但存在量很小，主要利用松节油中β-蒎烯热裂解产生。松节油受限于林业资源产量有限，β-蒎烯只占一小部分，因此难以获得大量的月桂烯。

利用微生物进行生物合成是获得月桂烯的一种有效途径，具有绿色、可持续和成本低的优点。月桂烯生物合成的限速酶之一就是月桂烯合酶。因此，开发一种高酶活的月桂烯合酶变体，能够提高月桂烯的产量。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种月桂烯合酶变体及相应核苷酸分子序列，所述月桂烯合酶变体能够提高月桂烯生物合成的产量。

第一方面，本发明提供一种月桂烯合酶变体，所述月桂烯合酶变体基于SEQ IDNO.17所示的野生月桂烯合酶trCsMS序列，包括至少一个以下位点中的氨基酸突变：P22，R43，N102，N106，K140，L423，D471，N481，E523。

进一步地，所述月桂烯合酶变体为trCsMS_M1～trCsMS_M8，所述trCsMS_M1突变氨基酸为N102K，L423Q，N481K；所述trCsMS_M2突变氨基酸为P22T；所述trCsMS_M3突变氨基酸为P22S；所述trCsMS_M4突变氨基酸为K140R,D471N；所述trCsMS_M5突变氨基酸为D471N,E523D；所述trCsMS_M6突变氨基酸为D471N；所述trCsMS_M7突变氨基酸为R43G,N106S,D471N；所述trCsMS_M8突变氨基酸为N481K。如下表1所示。

表1trCsMS突变体突变氨基酸列表

进一步地，所述月桂烯合酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～8所示任一序列。

第二方面，本发明提供编码第一方面所述月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列，所述核苷酸分子的序列为SEQ ID NO.9～16所示任一核苷酸序列。

第三方面，本发明提供第一方面所述月桂烯合酶变体的应用于月桂烯生产的方法。

进一步地，所述方法包括如下步骤：S1，对月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列编码基因进行表达载体构建；S2，构建含有月桂烯合成表达载体的菌株；S3，对S2所得菌株进行发酵培养。

进一步地，所述S1表达载体构建包括如下步骤：将月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列编码基因PCR扩增；将载体质粒pCC24线性化，将扩增产物和线性化的载体进行连接，得到月桂烯合成质粒；所述质粒pCC24含有异源的甲羟戊酸途径。

进一步地，所述PCR扩增使用引物MS-F/MS-R，所述引物序列为(5’-3’)：