[发明专利]一种用于改进微生物产生月桂烯的月桂烯合酶变体

权利要求书

1.一种月桂烯合酶变体，其特征在于，所述月桂烯合酶变体基于SEQ ID NO.17所示的野生月桂烯合酶trCsMS序列，包括至少一个以下位点中的氨基酸突变：P22，R43，N102，N106，K140，L423，D471，N481，E523。

2.如权利要求1所述的一种月桂烯合酶变体，其特征在于，所述月桂烯合酶变体为trCsMS_M1～trCsMS_M8：所述trCsMS_M1突变氨基酸为N102K，L423Q，N481K；所述trCsMS _M2突变氨基酸为P22T；所述trCsMS_M3突变氨基酸为P22S；所述trCsMS_M4突变氨基酸为K140R,D471N；所述trCsMS_M5突变氨基酸为D471N,E523D；所述trCsMS_M6突变氨基酸为D471N；所述trCsMS_M7突变氨基酸为R43G,N106S,D471N；所述trCsMS_M8突变氨基酸为N481K。进一步地，所述月桂烯合酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～8所示任一序列。

3.编码权利要求1所述月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列，其特征在于，所述核苷酸分子的序列为SEQ ID NO.9～16中所示任意一组核苷酸序列。

4.一种月桂烯生产的方法，其特征在于，应用权利要求1或2中所述月桂烯合酶变体。

5.如权利要求4所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1，根据月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列编码基因进行对表达载体构建；S2，构建含有月桂烯合成表达载体的菌株；S3，对S2所得菌株进行发酵培养。

6.如权利要求5所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，所述S1表达载体构建包括如下步骤：将月桂烯合酶变体的核苷酸分子序列编码基因PCR扩增；将载体质粒pCC24线性化，将扩增产物和线性化的载体进行连接，得到月桂烯合成质粒；所述质粒pCC24含有异源的甲羟戊酸途径。

7.如权利要求6所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，所述PCR扩增使用引物MS-F/MS-R，所述引物序列为(5’-3’)：

SEQ ID NO.18，MS-F：ggcatttcgtcagaattaaggatcttttaagaaggagatatacatggttgttaacaatagcag

SEQ ID NO.19，MS-R：gagatccttactcgagtttggatccttacttcgggatattgatcggggtg。

8.如权利要求7所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，使用BamHI酶切载体质粒pCC24完成线性化。

9.如权利要求8所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，所述S2中，将表达载体转入大肠杆菌构建菌株。

10.如权利要求9所述的月桂烯生产的方法，其特征在于，所述S3中，将构建菌株接种到LB培养基中作为种子液，经过37℃过夜培养后进行转接至发酵培养基，转接后在37℃培养5h，之后向其中加入IPTG进行诱导，并加入十二烷后于30℃摇床培养72h，发酵培养基组分如下：

发酵培养基中加入微量元素溶液，配方如下(每100mL)：