[发明专利]一种诱导基因表达的茎环DNA结构及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导基因表达的茎环DNA结构及其应用，涉及生物技术领域。本发明包括：针对特定的指标基因X，设计基因X第一个外显子(Exon1)的反义序列(E1‑AS)；并且在E1‑AS两端添加5‑10个由G和C组成的多聚序列，最终形成大约20‑40nt的茎环DNA(StemDNA)结构，该结构组成为：C(n)‑靶向序列(Tarseq:E1‑AS)‑G(n)；合成相应StemDNA序列，退火形成茎环结构；采用基因特异的茎环结构，增强了RNA‑DNA杂化双链的热稳定性，及茎环引物所产生的空间约束，使逆转录具有较高的灵敏性和特异性，最终增加了相关基因的转录表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种诱导基因表达的茎环DNA结构及其应用。

背景技术

目前，基因表达调控技术早已被广泛应用到生物医学研究领域。基因过表达以及敲降是常用的基因表达调控技术：对于基因过表达，我们可以导入外源基因也可以表达转录因子转录激活体内目的基因。对于基因沉默，我们可以通过导入外源shRNA和转录抑制等方式完成。敲降的手段多种多样，如化学合成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、载体构建短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、针对基因组敲降的CRISPR/Cas9、针对RNA的CRISPRi等。在之前的研究中用的较多的小双链RNA可以高效、高特异性地阻断体内特定基因表达，促使目的基因mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，即称为RNA干扰，或称转录后基因沉默技术。基因过表达的基本原理是通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。但基因过表达的技术很少，大部分科研工作者只了解构建外源过表达、CRISPR-SAM两种。因此，需要开发新的基因过表达技术，用于研究目的基因在疾病中的生物学功能和作用机制。

茎环(Stem-loop)指一种分子内碱基配对方式，与此形成的结构，可发生于单链DNA(ssDNA)，也常见于RNA分子中。当形成的循环较小时，也称为发夹(hairpin)或发夹环。此种结构会在某些条件下产生，通常是因为同一分子内的两个区域的核苷酸排列具有回文现象，这会使两段序列因为碱基的配对而形成一个状似棒棒糖的双螺旋结构，使DNA/RNA产生二级结构。茎环结构在高温条件下发生解链，避免了非特异性扩增和引物二聚体的发生，可以有效提高靶基因检测的特异性。然而，目前的涉及到茎环DNA结构介导的转录水平基因上调或者激活领域仍有待开发。

为了实现更加个性化、精细的基因调控，本发明专利报道开发了一种诱导基因表达的茎环结构DNA设计系统，采用基因特异的茎环结构，增强了RNA-DNA杂化双链的热稳定性，及茎环引物所产生的空间约束，使逆转录具有较高的灵敏性和特异性，最终增加了相关基因的转录表达。

发明内容

本发明目的在于设计诱导基因表达的茎环DNA结构。本方案提供了一种新型利用茎环结构DNA扩增方法，具有操作简单，快速灵敏，经济实惠的优点。本发明通过以下技术方案实现：针对特定的指标基因X，设计基因X第一个外显子(Exon1)的反义序列(E1-AS)，然后在两端添加5-10个(7个最佳)G和C组成的多聚序列，最终形成大约20-40nt的茎环DNA(StemDNA)结构，该结构组成为：C(n)-靶向序列(Tarseq:E1-AS)-G(n)。通过体外合成StemDNA序列。体外退火后转染靶细胞后检测细胞的靶基因表达，结果发现靶基因表达比例升高1.5—5000倍不等。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种诱导基因表达的茎环DNA结构，具体是针对特定的指标基因X，设计基因X第一个外显子(Exon1)的反义序列(E1-AS)，然后在两端添加5-10个G和C组成的多聚序列，最终形成20-40nt的茎环DNA(StemDNA)结构；该茎环DNA(StemDNA)结构组成为：

C(n)-靶向序列(Tarseq:E1-AS)-G(n)。