[发明专利]一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法

说明书

本发明涉及一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，涉及生物技术领域。本发明的一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，是以配方为脱脂奶粉100.00±0.50g/L、海藻糖20.00±0.50g/L、蔗糖30.00±0.50g/L和谷氨酸钠15.00±0.50g/L作为冻干保护剂保存菌种，并采用甘油保藏，通过优化冻干过程的工艺参数，获得的一种冻干保藏方法，该方法具有操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的优点。本发明的方法保藏的重组大肠杆菌菌种通过复苏菌种检测表达量，诱导0h、1h、2h及3h的蛋白表达量依次为3.2％、41.5％、50.2％、56％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法。

背景技术

菌种资源是人类的宝贵资源，国内外研究机构对菌种保藏都给予极大的关注，菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有形状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。菌种保藏的原理是根据生理生化特性，人为创造条件尽量降低生物体内的代谢活动，以达到延长生命、减少变异的目的。在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，因此菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的，其中低温可减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的，同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制。无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等；其次，应根据微生物生理、生化特点，人为的创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态；这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

目前常用的菌种保藏方法为液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、定期移植法、矿物油保藏法等。部分研究表明前两种方法保藏效果较好，适合菌种长期保藏。然而仍存在着问题，例如即便是同一物种的蛹虫草，不同研究人员使用相似的方法，得出的结论却不尽相同。同时，液氮超低温保藏法和真空冷冻干燥保藏法，需要良好的设备及技术，投入过高，不能广泛应用于生产；后两种方法虽然简单、价廉，但占据的保藏空间较大，且由于转管次数过多，变异的可能性增大，极易造成菌种退化，给生产带来损失。因此，探讨高效廉价、操作简单的菌种保藏方式非常必要，从而获得更加科学和实用的结果。基于以上原因急需研究一种操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的大肠杆菌菌种保藏方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单实用、保藏时间长、菌种质量稳定可靠、保藏成本低的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法。本发明采用一种专用的冻干保护剂配方保存菌种，并进行冻干程序保存，通过复苏菌种检测表达量，诱导0h、1h、2h及3h的蛋白表达量依次为3.2％、41.5％、50.2％、56％。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：

本发明的一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，包括以下步骤：

步骤1、材料准备

冻干保护剂配制：

冻干保护剂配方：脱脂奶粉100.00±0.50g/L、海藻糖20.00±0.50g/L、蔗糖30.00±0.50g/L、谷氨酸钠15.00±0.50g/L；

按照上述配方配制冻干保护剂，密封，于2-8℃保藏；

50％甘油配置：

按照甘油与水体积比为1:1量取，配制得到50％甘油，高温灭菌，备用；

步骤2、菌种复苏、传代