[发明专利]一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、材料准备

冻干保护剂配制：

冻干保护剂配方：脱脂奶粉100.00±0.50g/L、海藻糖20.00±0.50g/L、蔗糖30.00±0.50g/L、谷氨酸钠15.00±0.50g/L；

按照上述配方配制冻干保护剂，密封，于2-8℃保藏；

50％甘油配制：

按照甘油与水体积比为1:1量取，配制得到50％甘油，高温灭菌，备用；

步骤2、菌种复苏、传代

使用抗生素浓度为100μg/mL的LB培养基进行重组大肠杆菌菌种复苏和传代，将重组大肠杆菌菌种进行复苏，按比例接种，培养时间为10-18h，采用革兰氏染色法进行镜检，若发生污染则立即停止；

传二代种，按照比例接种，培养时间为4-9h，镜检同复苏过程；

传三代种，按照比例接种，培养时间为10-18h，镜检同复苏过程；

传四代种，按照比例接种，培养时间为2-4h，镜检同复苏过程，采用吸光度法对菌种活力进行检测，达到所要求的OD600值在0.6～1.0；

步骤3、甘油菌分装

按体积比1:1依次抽取50％甘油和步骤2的菌液加入到冻存管中，盖紧冻存管瓶盖，上下翻转，使其充分混匀；

步骤4、冻干菌分装

先将步骤3的菌液置于离心机中离心，抽取步骤1配制的冻干保护剂于离心管中，使其与菌体充分混匀，目测没有沉淀，按比例倒入冻干保护剂1:1定容，上下摇晃使其充分混匀，用移液枪抽取菌液分装于已灭菌西林瓶中，分装后半加塞方式加上已灭菌胶塞，转入铝盒并放入已灭菌的呼吸袋中，用封口机封口；

步骤5、菌种冻干

依次按照以下程序对步骤4的菌种进行冻干处理：

预冻期：在-50℃维持2.5小时以上；

一次干燥：真空度为12-17e^-2mbar，温度从-50℃逐渐升至25℃，时间为15～18h；

解析干燥：在真空度为0.1-2e^-2mbar，温度为25℃的条件下保持6-8h；

步骤6、菌种保藏

将步骤5获得的菌种包装，贴上标签，置于-80℃保存。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤1中配制的冻干保护剂使用前需高温灭菌。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤2中复苏过程按照菌液与培养基体积比1:250-1:500接种。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤2中传二代种过程中按照菌液与培养基体积比1:500-1:1000接种。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤2中传三代种过程中按照菌液与培养基体积比1:500-1:1000接种。

6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤2中传四代种过程中按照菌液与培养基体积比1:250-1:1000接种。

7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌种冻干保藏方法，其特征在于，步骤4中离心具体为8000rpm离心5min。