[发明专利]一种基于新型SMA膜蛋白稳定策略结合SPR的BCRP蛋白调节剂筛选方法及应用

说明书

本发明涉及药物筛选领域，具体是一种基于新型苯乙烯马来酸聚合物(SMA)膜蛋白稳定结合表面等离子共振(SPR)技术的乳腺癌耐药蛋白(BCRP)调节剂筛选方法，及其从中药中筛选BCRP蛋白调节剂的应用。本发明具有高效、专属、经济、便捷、快速等优点。本发明能显著提高BCRP蛋白调节剂评价或筛选效率，对潜在BCRP抑制剂的筛选以及进一步的临床应用等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及药物筛选(评价)领域，具体地说，是新型苯乙烯马来酸聚合物(SMA)膜蛋白稳定技术与表面等离子共振技术(SPR)结合所构建的活性蛋白芯片，以及利用该蛋白芯片进行快速、高效筛选与评价乳腺癌耐药蛋白(BCRP)调节剂的方法的建立与应用。

背景技术

化疗是治疗癌症的重要手段之一，对多数肿瘤有着明显的治疗效果，可使30％-40％的晚期癌症患者肿瘤得到缓解，60％-70％的患者肿瘤生长得到控制。但肿瘤多药耐药(Multidrug resistance，MDR)的产生严重影响了化疗药物对肿瘤治疗效果，据统计90％肿瘤患者的死亡与MDR相关。MDR的产生机制十分复杂，其主要机制之一是以BCRP为代表的ABC转运蛋白在肿瘤的侧群细胞中过表达，从而降低化疗药物在肿瘤细胞中的累积量，最终导致化疗失败。因此寻找适合的BCRP蛋白抑制剂作为抗癌药物的化学增敏剂，已成为肿瘤治疗中逆转MDR的有效策略。

近年来，评价与筛选BCRP抑制剂已成为抗肿瘤药物临床研究的前沿热点之一。建立高效快速的BCRP抑制剂筛选方法对于新型BCRP抑制剂的开发至关重要。目前筛选BCRP抑制剂的体外方法包括ATP酶活性测定法，双向转运实验与计算机模拟筛选技术。ATP酶活试剂盒可以测定多种转运蛋白(P-gp、BCRP、MDR 1)的调节剂的活性，提供小分子化合物和转运蛋白亲和力的信息，但该方法假阳性率较高且无法提供转运速率等参数。2017年，Locher课题组发表了由低温电子显微镜测定的人类BCRP蛋白的第一个高分辨率的结构，而在此之前小分子与BCRP蛋白结合以及是否存在一个或多个配体结合位点是未知的。这一研究成果不仅让研究者们可以重新构建人BCRP蛋白的原子结构，而且还提供了小分子与BCRP蛋白的结合位点信息，如Ko143的支架结构活性关系，这极大的促进了计算机辅助药物设计在BCRP抑制剂开发中的应用。但计算机模拟的假阳性结果较高，仍需要细胞实验进行补充验证化合物的活性。双向转运实验是体外鉴定P-gp和BCRP底物的黄金标准。双向转运实验常用的细胞系为Caco2细胞株，以带有荧光的BCRP底物-Hoechst 33342为检测目标，当Hoechst33342与潜在BCRP抑制剂共同使用时，根据Hoechst33342在细胞内累积量的变化来验证该化合物对BCRP的抑制作用，但该方法无法测定小分子与BCRP蛋白的亲和力参数，并且Caco2细胞中同时表达的其他转运蛋白降低了该方法的专属性。此外，上述方法还存在耗时、通量较低和特异性差等问题。因此，建立更加快速、专属的BCRP蛋白抑制剂筛选新方法，对于高效低毒的BCRP新型抑制剂的发现、以及进一步的逆转肿瘤MDR临床研究具有重要意义。

苯乙烯马来酸聚合物(Styrene Maleic Acid，SMA)是苯乙烯和马来酸酐通过自由基聚合得到一种性能优良的共聚物，该聚合物由亲水性的马来酸和疏水性的苯乙烯交替组成。与传统的膜蛋白稳定剂相比，该聚合物可以直接从细胞膜中提取膜蛋白，无需去污剂增溶步骤，使得膜蛋白可以保持在内源性脂质环境当中，最大程度保证膜蛋白的结构和功能完整。因此，SMA可以很好的解决BCRP蛋白因双亲性而导致的体外易聚集失活问题，是一个很有潜力的高分子聚合材料，有望应用于BCRP蛋白的稳定提取。