[发明专利]一种基于新型SMA膜蛋白稳定策略结合SPR的BCRP蛋白调节剂筛选方法及应用

权利要求书

1.一种基于SMA膜蛋白稳定结合SPR的BCRP蛋白调节剂筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)SMA-BCRP蛋白脂质体的构建；首先用新型的聚合物膜蛋白稳定材料SMA从LLC-PK1/BCRP细胞中萃取出BCRP蛋白，构建SMA-BCRP蛋白脂质体并验证BCRP蛋白活性；

(b)SRP蛋白芯片的构建；将SMA-BCRP蛋白脂质体偶联至L1芯片上，考察SMA-BCRP-L1蛋白芯片的专属性和稳定性，以及SMA聚合物残留对芯片的干扰；

(c)活性化合物的筛选；所构建的SMA-BCRP-L1蛋白芯片应用于从中药中筛选潜在的BCRP蛋白调节剂，并进行亲和力验证。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)所述的蛋白脂质体的构建，包括以下步骤：

(a1)细胞膜的提取；

采用超声破碎，差速离心的方式提取；

(a2)SMA萃取BCRP蛋白；

将SMA溶液和细胞膜混悬液混合，置于4℃摇床孵育，高速离心收集上清得到SMA-PK1和SMA-BCRP脂质体；所述的SMA溶液浓度1％-2.5％，细胞膜混悬液浓度20mg/mL-160mg/mL，孵育时间1h-12h；

(a3)ATP酶活性测定；

ATP酶活性测定分组为A:细胞膜-空白组；B:细胞膜-背景组；C:细胞膜-阳性对照组；D:SMA-BCRP-空白组；E:SMA-BCRP-实验组；F:SMA-BCRP-阳性对照组；A-C组用以确定该检测系统的适用性，系统适用性达到要求后测定BCRP蛋白的活性；在确定该检测系统工作良好的前提下，D-E组的RLU发光行为应与A-C组一致，表明SMA-BCRP中的BCRP蛋白活性良好。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(b)所述的SRP蛋白芯片的构建，包括以下步骤：

(b1)L1芯片SMA-BCRP蛋白脂质体的偶联；

蛋白脂质体的偶联流速为3-10μL/min，偶联时间0.5小时-4小时；FC1通道偶联SMA-PK1脂质体作为对照通道，FC2通道偶联SMA-BCRP脂质体作为检测通道；

(b2)SMA-BCRP-L1蛋白芯片专属性考察；

专属性考察的阳性药为BCRP特异性抑制剂或底物，阴性药为地塞米松；

(b3)SMA-BCRP-L1蛋白芯片稳定性考察；

测定蛋白偶联后0h-48h内的蛋白芯片稳定性，用阳性药亲和力参数KD的变化来表征蛋白芯片的稳定性；

(b4)SMA-BCRP-L1蛋白芯片SMA干扰考察；

SMA干扰考察为在FC1及FC2通道分别注入SMA溶液进行偶联，再加入阳性药，考察阳性药与芯片的是否结合以判断SMA对筛选系统是否存在干扰。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(c)所述的活性化合物的筛选，包括以下步骤：

(c1)活性化合物的初步筛选；

化合物的初筛浓度为0-128μM，流速为3-10μL/min，结合时间为30-60s，解离时间为60-300s；

(c2)亲和力验证；

化合物动力学分析浓度范围为0-128μM，流速为3-10μL/min，结合时间为30-60s，解离时间为60-300s。

5.一种如权利要求1-4任一所述的筛选方法在中药中筛选BCRP蛋白调节剂的应用。