[发明专利]基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用

说明书

本发明属于生物医药分离纯化的技术领域，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。本发明用自制浸提液从蚂蟥粉中粗提水蛭素，然后选用羧基磁性微球制备凝血酶亲和磁性微球，利用凝血酶亲和磁性微球进一步分离纯化，最终得到活性为17000ATU/g以上的天然水蛭素。本发明自制的浸提液能将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率；制备的凝血酶亲和磁性微球可充分利用其样品富集作用，与琼脂糖微球和聚合物微球相比可分离纯化得到活性及纯度更高的水蛭素，保存期长、质量稳定，可为保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，有利于工业化生产及应用。

技术领域

本发明属于生物医药分离纯化的技术领域，涉及动物有效成分的提取，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。

背景技术

水蛭素是从水蛭（Leech）唾液腺中分离纯化制得的一种由65-66个氨基酸残基组成的、无糖基化的小分子酸性单链多肽。水蛭素具有高度特异的抗凝血酶活性，可抑制凝血酶结合底物，是迄今为止发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，可改善血液微循环，发挥良好的抗凝化瘀效果，对人类心脑血管疾病，尤其是脑血栓等血栓性疾病具有显著的功效；此外，水蛭素还具有较强的抗氧化性，可协助机体免疫细胞识别、吞噬、包裹、清除自由基等，防止皮肤因被氧化而产生细纹、色斑、干燥等衰老现象。而与天然水蛭素相比，重组水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酪化，活性略低，对凝血酶的抑制作用仅为天然水蛭素的1/10。因此，天然水蛭素在医药、保健品及化妆品研究领域均具有巨大的应用前景。

目前天然水蛭素多是以活体水蛭为原料提取得到，如公开号为CN 102286108 A的专利提供一种天然水蛭素的生产方法先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉；公开号为CN 108727487 A的专利提供一种水蛭素的液膜萃取方法，将冷冻水蛭捣碎制得水蛭素粗提液；公开号为CN 102964446 A的专利提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法。但是，以活体水蛭为原料提取时方法大多繁杂，耗时久，不利于工业化生产；同时提取得到的水蛭素有效成分活性不高，多在150-6000ATU/g左右，杂质含量也较高，不适合注射用药。而公开号为CN 107936115 A的专利提供的水蛭素提取方法，虽然从水蛭粉末中提取水蛭素，操作简单，但所得水蛭素的活性依然较低。因此，开发一种步骤简单且水蛭素产品活性更高的水蛭素提取方法，对水蛭素的进一步研究和应用推广具有十分重要的意义。

发明内容

针对背景技术中存在的技术问题，本发明提出基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用，该方法提取得到活性较高的高质量天然水蛭素，且操作简单、成本低，可实现快速工业化生产。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，包括以下步骤：

（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：按照蚂蟥粉重量的2-6倍加入浸提液，浸泡，超声，离心取上清，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节pH至4.5，利用不同蛋白在不同pH下溶解度的差异将一部分杂蛋白沉淀去除，再次离心取上清液，调节pH至7.0，为下一步中性条件下水蛭素与磁球的结合做准备。

（2）凝血酶亲和磁性微球制备：将凝血酶与羧基磁性微球混合反应，然后加入乙醇胺继续反应，分离去除液体，经洗涤，得凝血酶亲和磁性微球；其中，加入乙醇胺是为了屏蔽磁球表面未完全反应的羧基，防止吸附蚂蟥粗提液中的杂蛋白，造成水蛭素纯度下降。

（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将步骤（2）的凝血酶亲合磁性微球加入到步骤（1）的水蛭素粗提液中混合均匀后静置，随后磁分离去除上清，再依次进行洗涤和洗脱，收集洗脱液。

（4）脱盐浓缩：将步骤（3）的洗脱液透析处理，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(40-70℃，100-130r/min)进行浓缩，去除30-80%的水分后，将浓缩液于-8℃冷藏备用。