[发明专利]基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取蚂蟥粉，加浸提液浸泡后进行超声及离心，收集上清液并调节pH，得水蛭素粗提液；

（2）将凝血酶与羧基磁性微球混合反应，然后加入乙醇胺继续反应，分离去除液体，经洗涤，得凝血酶亲和磁性微球；

（3）将步骤（2）的凝血酶亲合磁性微球加入到步骤（1）的水蛭素粗提液中混合均匀后静置，随后分离去除上清，洗涤所得沉淀，经洗脱，收集洗脱液；

（4）将步骤（3）的洗脱液透析处理，然后进行浓缩及冻干，即得水蛭素。

2. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中浸提液为蚂蟥粉重量的2-6倍；所述浸提液的成分为50mM Tris、10mM EDTA、150mM 氯化钠、3% SDS、2% Triton X-100和2% 脱氧胆酸钠。

3.根据权利要求2所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，所述收集上清液并调节pH具体为：收集上清液并调节pH至4.5，再次离心取上清液，调节pH至7.0。

4.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中凝血酶和乙醇胺使用时均预先溶于浓度为50mM/L、pH5.5的MES缓冲液；羧基磁性微球预先用活化剂EDC/Sulfo-NHS活化；凝血酶与羧基磁性微球在室温下反应2-3h，然后加入乙醇胺继续在室温下反应1-1.5h。

5.根据权利要求4所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述凝血酶的活性为2ku/mg，凝血酶与MES缓冲液的质量体积比为1:(1-5)mg/mL；羧基磁性微球的粒度为2.5-3.0μm；凝血酶与乙醇胺的质量体积比为(4-1):1mg/mL；乙醇胺与MES缓冲液的体积比为1:(5-10)。

6. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中洗脱使用的洗脱液为含(0.01-0.03)mol/L KCl-(0.05-0.2)mol/L HCl的水溶液。

7.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中透析具体为使用截留分子量小于等于5000Da的透析袋，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；所述浓缩具体为使水分去除率达到30-80%。

8.权利要求1-7任一项所述的分离纯化方法得到的水蛭素。

9.根据权利要求8所述的水蛭素，其特征在于：所述水蛭素的活性为17167ATU/g。

10.权利要求8所述的水蛭素在制备药品、保健食品或化妆品中的应用。