[发明专利]非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法、其装置及应用

说明书

本发明提供了一种非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法、其检测装置及应用。为了进一步检测该方法的灵敏度，本发明进一步用数字PCR进行最低检测限的确定。三个通道的最低检测限由荧光定量PCR的119拷贝数/μL，183拷贝数/μL和8.6×10supgt;3/supgt;PFU/mL降低到0.484拷贝数/μL，0.352拷贝数/μL和0.352拷贝数/μL，极大提高了该方法检出的灵敏度。并且再次用数字PCR方法验证了本发明的检测的特异性。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法、其检测装置及应用。

背景技术

猴痘(monkeypox)，一种传染性的人畜共患病，属于正痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，正痘病毒属。猴痘主要流行于中非和西非的热带雨林。自2003年出现于西半球，之后的研究发现猴痘存在两个分支，西非分支(现在的clade IIa,clade IIb)和刚果分支(现在的clade I)。西非分支和刚果分支的序列同源性为99％。西非分支比刚果分支毒力更轻，感染后出现更轻微的皮疹和更少的病灶。有研究表明给严重联合免疫缺陷的BALB/c小鼠腹腔注射西非株与注射刚果株相比，小鼠表现出更长的平均生存时间。

从2022年的1月1日到10月6日，全球实验室确诊的猴痘病例有36412例。2022年的7月23日，世界卫生组织总干事宣布，猴痘构成国际关注的突发公共卫生事件。因此，在当前猴痘流行的局势下，十分有必要开发新的诊断方法快速准确检测和区分猴痘病毒不同分支。

猴痘的实验室诊断十分重要因为感染猴痘后的临床表现与其他“痘样”疾病的临床表现非常相似，例如天花和鸡痘。病毒分离可靠特异，但却有暴露的风险；由于正痘病毒之间的交叉反应，血清学检测容易产生假阳性；PCR反应有很高的灵敏度并且只需要极少的样本量。但传统的PCR方法需要结合限制性片段长度多态性分析或者琼脂糖凝胶电泳，一代测序等技术，耗时费力。因此，快速而灵敏的基于Taqman探针的方法应运而生。

现有的区分猴痘病毒西非株和刚果株的方法主要是利用西非株或者刚果株特异性缺失。比如：利用猴痘病毒西非株C3L基因缺失检测猴痘病毒刚果株，而利用猴痘病毒刚果株G2R基因有3bp缺失检测猴痘病毒西非株；利用西非株A型包涵体蛋白基因比刚果株多453bp，根据传统的聚合酶链式反应结合限制性内切酶方法区分条带大小；利用西非株A型包涵体蛋白基因比刚果株多453bp，设计两条特异性反向引物。主要存在的问题：耗时；需要针对不同的基因；常需要两对引物等；不能在同一个反应里同时检测区分猴痘病毒西非分支和刚果分支。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法、其检测装置及应用。能同时快速检测并区分猴痘病毒clade I,猴痘病毒clade II以及其他正痘病毒的数字PCR方法，该发明应具有特异性和灵敏性。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“PCR”是指：聚合酶链式反应。

术语“dPCR probe Master mix”是指：数字PCR预混液。

术语“clade I”是指：猴痘病毒刚果分支。

术语“clade II”是指：猴痘病毒西非分支。

术语“FAM”是指：羧基荧光素。

术语“CY5”是指：磺基菁5。

术语“HEX”是指：六氯丁二烯荧光素。

术语“BHQ1”是指：黑洞淬灭基团1。

术语“BHQ2”是指：黑洞淬灭基团2。

术语“PUC57载体”是指：重组大肠杆菌PUC57质粒载体。