[发明专利]非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法、其装置及应用

权利要求书

1.一种非诊断目的检测并区分正痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建质粒，合成上游引物和下游引物；

(2)将步骤(1)中构建的质粒稀释后配置反应体系，所述反应体系包：dPCR probeMaster mix、上游引物、下游引物、探针和模板DNA；和

(3)通过数字PCR法来扩增检测并区分正痘病毒；

其中：所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述步骤(1)中构建的质粒稀释的倍数选自以下一种或多种：2倍、3倍、4倍、5倍、10倍，更优选选自以下一种或多种：2倍、5倍、10倍，进一步优选为10倍或2倍。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中：所述数字PCR法包括：50～80℃3～10min，80～100℃12～20min，80～100℃5～15s,50～80℃20～40s 30～45个循环，50～80℃50～70s，优选包括：50～70℃4～8min，90～100℃12～18min，90～100℃10～15s,50～70℃25～35s 30～45个循环，50～70℃55～65s，最优选包括：60℃5min，95℃15min，95℃15s,60℃30s 45个循环，60℃1min。

4.一种用于检测并区分正痘病毒的装置，其特征在于，所述装置包括：

(A)引物合成及质粒构建机构；

(B)反应体系配置机构；和

(C)数字PCR分析机构；

其中，所述反应体系配置机构包括：dPCR probe Master mix、上游引物、下游引物、探针和模板DNA，并且，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的序列如SEQID NO:2所示。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法或根据权利要求4所述的装置，其特征在于：所述质粒的载体选自以下一种或多种：PUC57载体、PBR332载体、PUC18载体、PUC19载体、PGEM-T，优选选自以下一种或多种：PUC57载体、PUC18载体、PUC19载体，最优选为PUC57载体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法或装置，其特征在于，所述探针包括：猴痘病毒cladeI探针、猴痘病毒clade II探针、以及至少一种其他正痘病毒探针；

优选地，所述猴痘病毒cladeI探针的序列如SEQ ID NO:3所示；

优选地，所述猴痘病毒clade II探针的序列如SEQ ID NO:4所示；和/或

优选地，所述其他正痘病毒探针的序列如SEQ ID NO:5所示。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法或装置，其特征在于，所述dPCR probeMaster mix包括：dPCR反应缓冲液、Taq聚合酶、AmpErase酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP和叠氮化钠；和/或

所述模板DNA的序列如SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7所示。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或装置，其特征在于：

所述dPCR probe Master mix的用量为10-15μL，优选为10～12μL，最优选为12μL；

所述上游引物的用量为0.5～2.0μL，优选为0.8～1.5μL，最优选为1μL；

所述下上游引物的用量为0.5～2.0μL，优选为0.8～1.5μL，最优选为1μL；

所述猴痘病毒cladeI探针、所述猴痘病毒cladeII探针和所述其他正痘病毒探针的体积比为1：1：1；和/或

所述模板DNA的用量为3～10μL，优选为5～8μL，最优选为5μL。

9.权利要求4至8中任一项所述的装置在制备用于检测并区分正痘病毒的医疗产品中的应用。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法、装置或应用，其特征在于，所述正痘病毒为猴痘病毒，优选为猴痘病毒西非株和/或猴痘病毒刚果株。