[发明专利]一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，涉及疫苗制备技术领域，所述外膜囊泡为夹膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC44502株分泌。本发明首次将多杀性巴氏杆菌外膜囊泡作为疫苗免疫动物，通过动物试验证明本发明多杀性巴氏杆菌外膜囊泡具有显著预防多杀性巴氏杆菌病的效果，可用于制备预防多杀性巴氏杆菌病的产品，从而应用于预防多杀性巴氏杆菌病、避免细菌耐药性，具备良好的实际应用价值。

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，更具体的说是涉及一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用。

背景技术

外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌表面分泌的产物，是细菌外膜在一定的机制下发生出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构，这种结构包括了外膜以及周质成分。外膜囊泡大多数为球形，直径大约在20–250nm之间。1959年，De等首次发现霍乱弧菌滤除细菌后的培养液能够诱导家兔对霍乱弧菌的免疫反应。Chatterje等在研究对数生长期霍乱弧菌的超微结构时，发现在液体培养基无菌滤液中有革兰氏阴性菌细胞壁出芽形成的囊泡，而且在外膜容易发生囊泡出芽的位点附近，颗粒物质含量较高，这些颗粒可以随着细胞质进入出芽的囊泡中。OMVs的产生代表着细菌具有向外部环境释放大量的，复杂的蛋白组分和磷脂的独特机制。后来的研究发现，几乎所有的革兰氏阴性菌都能产生OMVs，其化学结构的组成成分除了外膜蛋白还有其他一些膜结构成分，所以人们将这种膜结构的囊泡称为外膜囊泡。

随着公共卫生的进步，细菌感染发生有所降低，但细菌感染仍然是导致人类生病和死亡的主要原因之一。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略。高效的疫苗必然具备三大因素，(1)抗原：能够触发免疫反应，产生免疫记防止机体受到进一步的攻击。(2)佐剂：保证免疫反应足够强大。(3)具一定的安全性。

OMVs中包含的外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的LPS可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性。所以这些因素促使OMVs成为开发非复制性高效疫苗的热门选择。

现有多杀性巴氏杆菌疫苗种类包括牛Pm灭活疫苗、牛Pm弱毒活疫苗、牛Pm亚单位疫苗。但灭活疫苗接种后不能在动物体内繁殖，因此使用时接种剂量较大，接种次数较多，免疫期较短，通常需要加入适当的佐剂以增强免疫效果。弱毒活疫苗运输和存储不方便，并且存在可能毒力返强的现象。亚单位疫苗免疫原性较低，需与佐剂合用才能产生好的免疫效果。

多杀性巴氏杆菌病的预防与诊疗是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡及其制备方法与应用，本发明疫苗的产出旨在增强免疫效果，产生良好的交叉免疫性，提高动物保护率，避免细菌耐药性造成的细菌病难以控制的现状实现对牛多杀性巴氏杆菌病的有效预防。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡，所述外膜囊泡为夹膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC44502株分泌。

作为优选的技术方案，所述外膜囊泡具有双层膜结构的囊泡状小体，携带细菌外膜和周质成分，包括酶、毒力因子、细菌特异性抗原和多种病原相关分子模式。

作为优选的技术方案，所述外膜囊泡粒径在200nm以内，蛋白条带大小集中在33KDa-45 KDa之间。

本发明的另一目的是，提供上述牛多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：

(1)将荚膜B群牛多杀性巴氏杆菌CVCC 44502株培养到稳定期，得到菌液；

(2)将菌液10000rpm/min，4℃，离心10min，取上清过0.45μm滤膜；