[发明专利]一种检测多种疾病相关基因突变类型的引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及一种检测多种疾病相关基因突变类型的引物组、试剂盒和方法。本发明能够同时检测遗传性耳聋、地中海贫血以及脊髓性肌萎缩症疾病相关基因突变类型，仅需一个管，一次实验就可同时检测临床常见已知致病性的SNP、INDEL以及拷贝数变异，显著提高三种疾病的检测效率和临床检测的标准化程度。其中所述引物组，包含：1)检测遗传性耳聋的基因突变类型的引物如SEQ ID NO:1‑30所示；2)检测地中海贫血的基因突变类型的引物如SEQ ID NO:31～340所示；3)检测脊髓性肌萎缩症的基因突变类型的引物如SEQ ID NO:341～350所示；4)检测β‑actin管家基因的引物如SEQ ID NO:351‑352所示。

技术领域

本发明属于生物技术和医学研究应用领域，具体涉及用于检测遗传性耳聋、地中海贫血和脊髓性肌萎缩症疾病相关基因突变类型的引物组、试剂盒和方法。

背景技术

为有效降低因遗传导致的出生缺陷的发生，国家药监局近年来相继审批通过了多款遗传病检测相关产品，其中遗传性耳聋、地中海贫血、脊髓性肌萎缩症三个疾病格外受到关注。

遗传性耳聋是典型的单基因病,遗传异质性强。目前遗传性耳聋基因筛查所用技术平台包括荧光定量PCR、PCR+导流杂交法、微阵列芯片技术以及高通量测序等，其具体的检测原理存在差异，目前以仅包含PCR扩增反应或后续结合探针杂交反应进行位点检测的试剂盒较为常见。这些产品覆盖范围和致病位点各有不同，但对于大多数产品来说，大多会选择将线粒体DNA(mtDNA)突变检测纳入到产品检测中。由mtDNA突变而引起的遗传性耳聋包括综合征型遗传性耳聋和非综合征型遗传性耳聋，其中mtDNA 12SrRNA上的m.1555AG、m.1494CT突变是氨基糖苷类药物致聋的易感位点。此外，其他mtDNA突变还可能引起综合征型遗传性耳聋，例如母系遗传糖尿病伴遗传性耳聋等。但是，与其它胚系突变不同的是，线粒体DNA在细胞复制的过程中mtDNA突变随机分配，母亲-子代突变比例可能差异较大，mtDNA存在状态阈值，即只有突变型DNA达到一定负荷率或mtDNA功能缺陷到一定程度才会产生相应表型。因此，这些年来，很多学者建议应该增加线粒体异质性比例的检测，以便更准确的评估线粒体突变在疾病发生中的角色！在目前已知的检测方法中，高通量测序方法既可以检测常染色体遗传性耳聋突变，且能同时对线粒体异质性比例进行分析。然而，采用基于扩增子建库技术的高通量测序进行线粒体突变检测会带来另外一个问题：线粒体的异质性因人而异，线粒体基因组的拷贝数与染色体是截然不同的，这就导致多重PCR在扩增线粒体DNA和基因组DNA时，起始的DNA模板量是不同的，即初始投入模板的拷贝数不同，这就为后续PCR条件优化和后续的生物信息分析带来挑战。

我国目前存在的地中海贫血类型主要为α地中海贫血和β地中海贫血，二者的发病原因存在细微差异，其中α地中海贫血是由α血红蛋白基因的缺失造成的，少数是由点突变造成；而β地中海贫血主要是由β血红蛋白基因点突变，少数为基因缺失。这种差异导致了检测技术难度不同，目前在临床诊断上，以PCR为基础的检测方法，比如以Gap-PCR方法虽然可以有效的区分不同型别的地中海贫血，但因为方法学本身的局限性，会导致不同程度的假阳性或假阴性。近些年，有学者尝试采用NGS测序方法，但多是采用液相捕获技术进行；扩增子建库进行地中海贫血检测，也主要是集中在以点突变为主的Beta地中海贫血(CN105331694B)，对于大片段缺失为主的α地中海贫血使用常规扩增子建库方法检测，仍有技术难度。这种难度主要来自于地中海贫血2个关键基因HBA1和HBA2的编码区域完全相同，且地中海贫血断点区域多落于内含子区，一般而言，多重扩增PCR的GC含量在40％～60％之间，最佳为50％。然而内含子区域GC含量高，部分区域达80％以上，严重影响引物扩增效率，导致引物扩增不均匀，进而影响地中海贫血缺失片段的判断。因此，使用扩增子建库，平衡各引物之间的扩增效率，尽量保证扩增的均一性，对于地中海贫血的大片段缺失的判断尤为重要。