[发明专利]一种定量检测D-二聚体的试剂盒的制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种定量检测D‑二聚体的试剂盒的制备方法与应用。所述试剂盒包括检测卡，所述检测卡包括卡壳和试纸条，所述试纸条包括PVC底板，所述PVC底板上依次搭接的样品垫、标记垫、缓冲垫、硝酸纤维素膜及吸水纸；所述标记垫上吸附有稀土Eusupgt;3+/supgt;荧光微球，微球标记有D‑二聚体单克隆抗体1以及羊抗鸡IgY抗体；所述硝酸纤维素膜上依次设有检测线和质控线，其中。本发明的优点在于检测检测范围宽、准确度高；同时，本试剂盒可直接检测全血样本，而无需其他处理如离心、稀释等。因此，成本低廉，可用于救护车、急救室、社区医院，节约诊断时间和诊断成本，为血栓患者快速诊断提供方便，具有一定的应用前景。

技术领域

本发明属于诊断试剂盒技术领域，具体涉及一种宽线性范围全血D-二聚体免疫层析法检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

当机体受损伤或其他刺激时，凝血系统将被激活，凝血酶产生，凝血酶将可溶性纤维蛋白原转化为可溶性的纤维蛋白单体，该单体会自动聚合成网状多聚体，在凝血酶和Factor XIIIa因子的作用下单体之间共价交联形成交联纤维蛋白。纤维蛋白的形成触发了纤溶系统的激活和活性纤维蛋白溶解酶(纤溶酶)的产生；后者将交联纤维蛋白降解成不同大小的可溶解的碎片，其中含有其特异降解产物D-二聚体。D-二聚体只有在交联型纤维蛋白形成和降解时才能产生，因此D-二聚体是凝血和纤溶系统激活的特异性标记物，也是血栓形成活性的间接标记物。因此D二聚体可反映血栓性疾病的发生和纤溶状态，尤其是非血栓性疾病的阴性排斥反应。

健康人体内的D-二聚体水平较低，而在与血栓形成相关的情况下，D-二聚体水平升高。D-二聚体水平的升高在血栓开始形成后的2h左右可被检测到，且生成的D-二聚体在体内的半衰期约为7-8h，因此快速的D-二聚体检测十分重要。

D-二聚体的检测方法学都是基于抗原-抗体免疫反应，目前市面上有许多D-二聚体检测方法，包括全血凝集检测、酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光(CLIA)免疫荧光检测(ELFA)、免疫比浊法检测。其中，全血凝集试验灵敏度较低，只能半定量检测；免疫比浊法检测是基于浊度的变化，其样本类型局限为枸橼酸盐血浆，不能进行全血D-二聚体快速检测；ELISA和CLIA一般包括多步骤的洗脱，操作较为繁琐、费时，很难满足D-二聚体快速检测；ELFA法可分为定性的胶体金免疫层析法和定量的荧光免疫层析法(LFA)，但胶体金法只能定性检测，且容易受类风湿因子、肝素及血脂的影响，结果准确性差。LFA以荧光材料(荧光素、有色染料如尼罗红、量子点、镧系元素等)作为示踪物，通过仪器检测荧光信号，定量分析D-二聚体含量，灵敏度高，稳定性好，具有操作简单、检测快速、成本低廉、不需要复杂的操作仪器和专业的操作人员的优点，是实现D-二聚体快速检测最适合平台。

但是目前市场上使用的基于LFA的D-二聚体检测商业试剂盒因Hook效应导致高浓度样本(10mg/L)测试准确度低。有文献报道，在标记垫下方增加糖处理垫能减缓标记抗体的释放以减轻夹心LFA中的Hook效应，而不需要额外的手动步骤。另有文献提到，可以通过在测试线盒抗原线之间增加抗原线，对三条线的强度产生的数据处理达到消除Hook效应的目的。专利CN109813910A提到利用竞争性免疫反应可以消除钩状效应的方法，即在试剂R1中加入被测对象相对应的抗原或抗体，在试剂R2中加入被测对象对应的抗体或抗原致敏的胶乳颗粒以实现消除Hook的目的。