[发明专利]一种利用荧光显微镜观察茶树表皮毛和气孔形态的方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光显微镜观察茶树表皮毛和气孔形态的方法，涉及生物技术领域。包括以下步骤：(1)取样；(2)固定处理；(3)漂洗；(4)透明处理；(5)观察；(6)统计。本发明方法简单易操作，效率高，重复性好，成本低，观察清晰，效果好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种利用荧光显微镜观察茶树表皮毛和气孔形态的方法。

背景技术

茶是世界上重要的无酒精饮料之一，制茶的主要原料为茶树较嫩的芽叶，茶树芽叶茸毛越多，表明芽叶越嫩，且茶树表皮毛基部有腺细胞，能分泌芳香物质，使茶叶具有特殊香气。茶树叶片茸毛的数量和质量是评定茶树品种主要经济性状之一，芽叶茸毛越多，制成的茶叶质量也越好。芽叶茸毛含有更高的氨基酸和较少的多酚类物质，能够增加茶叶的鲜甜且减少苦涩，使得茶叶口感品质更佳。茶树茸毛不仅能够提高茶汤的口感品质，还能显著增强茶树对生物和非生物胁迫的抗性，茸毛的长度、粗细、分布对茶叶嫩叶萌发和抗寒、减少水分流失、防止太阳过度辐射等起到重要作用，并且能够在一定程度上降低病虫害侵袭。因此，研究茶树表皮毛形成的调控机制对于茶树优良品系育种具有重要的意义，而观察表皮毛的形态与分布等特征对于更深层次的研究具有重要的推动作用。目前观察植物表皮毛的形态和分布通常采用体视显微镜、亮视野显微镜和扫描电子显微镜，对于茶树叶片，体视显微镜放大倍数不足以进行表皮毛和气孔形态的观察，又由于茶树叶表皮无法撕离且叶片较厚，故无法使用亮视野显微镜观察表皮毛和气孔，而扫描电子显微镜不仅价格昂贵，操作过程也较为复杂，因此，如何快捷且清晰地观察到茶树表皮毛形态与分布，是有待解决的问题。

植物的气孔控制着植物蒸腾和光合两个基本的生命过程，气孔一般是由一对保卫细胞围绕一个孔隙构成，往往周围还会有副卫细胞分布。植物是通过改变气孔孔径的大小来调节光合和蒸腾的速率从而适应周围环境变化的，通过观察植物气孔数量与分布能够在一定程度上反映植物对于环境因子的响应。在茶树中，不同品种其气孔也存在一定差异，例如，气孔大小和密度随品种的不同而不同，在野生种中异型气孔是普遍存在的，生长成熟度不同异型气孔出现的概率也不同，在同一片茶叶中按叶尖、叶中部、叶基部气孔依次减少，且茶树的抗虫性与气孔密度密切相关，由此可见观察茶树气孔对于茶树品种鉴定以及抗性的研究都具有重要作用。

茶叶的结构与品种和生长环境是密切相关的，不同的品种其结构也不同，同一品种因生态因子的不同而呈现出结构上的差异。但尽管有这些复杂的变化，茶叶的基本结构是不变的，表现为典型的背腹叶，表皮的附属物(气孔器与表皮毛)均集中在下表皮。因此在观察茶树叶片表皮毛和气孔时，都是将叶片下表皮朝上进行观察。目前植物气孔观察一般采用渗入法、印迹法、固定法和电镜扫描法，渗入法主要用于观察气孔开度，印迹法要求一定操作技术，且对于形状不规则的组织效果不佳，固定法需要撕下叶片表皮，然而茶树叶片表皮无法撕取，电镜扫描不仅成本高，操作过程也很复杂，因此，探索一种用材简单、操作方便的茶树气孔观察方法，是目前有待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了种利用荧光显微镜观察茶树表皮毛和气孔形态的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用荧光显微镜观察茶树表皮毛和气孔形态的方法，包括如下步骤：

(1)取样：采摘新鲜健康带叶的当年生枝条，切取块状样品；

(2)固定处理：将切割的样品材料置于0.8～2mL固定液中，固定至样品完全脱色；

(3)漂洗(此步骤可省略)：将样品从固定液中取出，用水漂洗1分钟；

(4)透明处理：将固定好的材料转移至0.8～2mL透明液中，过夜后获得完全透明的样品材料；

(5)观察：将样品材料有表皮毛的一面朝上平铺于载玻片上，在样品上方滴适量浓度为5％～20％的稀甘油，盖上盖玻片，轻轻压平，在荧光显微镜下观察并拍照；