[发明专利]一种检测CTC抵抗NK细胞杀伤的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测CTC抵抗NK细胞杀伤的试剂盒及其应用。本发明基于RNA‑seq技术结合QRT‑PCR技术检测发现，血小板可上调CTC表面CD155表达；通过体内实验，进一步发现CD155高表达促进肝癌细胞免疫逃逸，NK细胞的功能下降，且杀伤能力减弱。因此，本发明提出一种通过直接检测CTC上粘附性的血小板以及CTC表面CD155表达，而无需将NK细胞及肿瘤细胞共培养，即可评估CTC抵抗NK细胞杀伤的能力的试剂盒。本发明试剂盒可用于直接检测免疫逃逸型CTC，尤其是检测逃避NK细胞杀伤的CTC，通过对CTC上CD155染色即可进行评估，无需与NK细胞共培养，大大减少了试剂成本及操作时间。

技术领域

本发明涉及一种检测CTC抵抗NK细胞杀伤的试剂盒及其应用，属于生物医学检测技术领域。

背景技术

血小板作为血液循环系统中重要组成部分，在维持机体凝血功能中发挥核心作用。但近年来研究发现血小板在肿瘤转移的过程中同样举足轻重。其中，血小板促进CTC免疫逃逸，是肿瘤细胞在血液中存活并形成转移的重要方式之一。已有研究表明，血小板与CTC可发生膜融合现象，使肿瘤细胞表达血小板类似粘附分子或降低肿瘤特异性抗原表达，逃避免疫细胞监视；也可通过分泌可溶性细胞因子，直接影响免疫效应细胞表面受体表达，进一步抑制免疫细胞功能；活化的血小板还能通过增强免疫抑制细胞功能，发挥协同效应促进免疫耐受微环境形成，保护CTC。我们在前期研究中通过体内实验发现，血小板粘附的CTC可以躲避NK细胞攻击，造成远处转移(如图1所示)。然而，如何鉴定病人样本中粘附CTC的血小板现无稳定的检测方案。既往研究中，检测肿瘤细胞能否抵抗NK细胞的杀伤，是通过将NK细胞与肿瘤细胞共培养的方法，该方案操作繁琐，且多步骤耗时，成本高，具体操作是首先通过Ficoll密度梯度离心法获取患者的PBMC细胞；通过流式细胞数进行分选或通过磁珠阴性/阳选方法获取NK细胞；将肿瘤细胞与NK细胞以不同比例的数量进行共培养24h后，通过流式细胞术检测NK细胞上IFN-r及CD107a等表达，评估NK细胞活性，以及通过共培养后检测肿瘤细胞死亡比例，评估NK细胞的杀伤能力。

目前，肿瘤细胞表面共免疫抑制分子或共免疫刺激分子表达异常是肿瘤发生免疫逃逸的重要原因之一。血小板能否通过改变肿瘤细胞表面免疫检查点表达影响CTC免疫逃逸无研究报道。

发明内容

本发明的目的是：针对目前鉴定病人样本中粘附CTC的血小板能否逃避NK细胞的杀伤尚无稳定的检测方案，本发明提出一种检测试剂盒，为一种结合EpCAM，Pan-CK，CD45，CD155，CD41，DAPI抗体的检测试剂盒，可用于评估循环肿瘤细胞(CTC)能否逃避NK细胞的杀伤。

为了实现上述目的，本发明提供了检测试剂在制备用于检测CTC抵抗NK细胞杀伤的试剂盒中的应用，所述检测试剂至少包括：用于检测CTC标志物EpCAM、Pan-CK的试剂，用于检测白细胞标志物CD45的试剂，用于检测细胞核标志物DAPI的试剂，用于检测血小板标志物CD41的试剂，以及免疫抑制性检查点一抗CD155。

优选地，所述检测试剂具体包括：Alexa Fluor 555标记的Pan-ck，PE标记的EpCAM一抗混合物，Alexa Fluor 647标记的CD45一抗，FITC标记的CD155一抗，Alexa Fluor 647标记的CD41一抗，和细胞核染液DAPI。

优选地，所述检测试剂的浓度分别为：0.1mg/mL Alexa Fluor 555标记的Pan-ck，0.1mg/mL PE标记的EpCAM一抗混合物，0.1mg/mL Alexa Fluor 647标记的CD45一抗，0.25μg/100μL FITC标记的CD155一抗、Alexa Fluor 647标记的CD41一抗，8.4μM细胞核染液DAPI。

优选地，所述试剂盒还包括：含0.2％多聚甲醛固定剂、含0.3％皂苷及0.5％牛血清白蛋白的破膜剂、含20％的牛血清白蛋白的封闭液、以及含0.1％防腐剂的细胞洗液。