[发明专利]一种基因修饰的T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种基因修饰的T细胞，其可以共表达靶向PD‑1的shRNA、IL‑24和NKG2D CAR。本发明利用shRNA基因沉默技术抑制PD‑1蛋白在NKG2Dx24CAR‑T细胞中的表达，制备出PD‑1supgt;KD/supgt;NKG2Dx24CAR‑T细胞，该细胞由于不表达PD‑1而避免受肿瘤微环境中PD‑L1分子介导的免疫抑制，能够长效维持抗肿瘤活性。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基因修饰的T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)治疗是近些年开发出的一种肿瘤靶向过继细胞疗法。其大致原理是通过基因编辑的方法使T细胞表达能够特异性识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体，从而赋予其对肿瘤细胞的特异性杀伤能力。靶向CD19和BCMA抗原的CAR-T细胞已经在血液肿瘤治疗中显示出惊人的疗效。然而，CAR-T细胞治疗实体肿瘤仍然面临着诸多挑战。在实体肿瘤治疗中影响CAR-T细胞疗效的最主要因素包括：1.缺乏肿瘤特异性抗原，CAR-T细胞治疗会产生脱靶毒性；2.抑制性肿瘤微环境导致CAR-T细胞失能甚至凋亡；3.实体肿瘤细胞的高度异质性，识别单一肿瘤特异性抗原无法完全清除肿瘤细胞等等；因此，要想克服上述阻碍CAR-T细胞有效杀灭实体肿瘤的因素，就必须通过全新的基因编辑策略对T细胞进行改造。

NKG2D是一种在人类天然杀伤细胞、CD56+和CD8+T细胞表面表达的激活性受体，在天然免疫中发挥着重要的作用，参与病毒感染细胞的识别及NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。与其他NKG2受体不同，NKG2D拥有多种配体，包括人类MHC-I类链相关分子(MICA和MICB)和人类UL16结合蛋白(ULBPs，也称为人类RAET1)。MIC和ULBP均被认为是肿瘤相关性抗原，在多上皮来源的肿瘤，比如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤以及黑色素瘤中广泛表达。将CD3ζ与NKG2D串联设计进行融合表达，则NKG2D与配体结合后使CD3ζ亚基的ITAM基序磷酸化，进而进一步活化下游分子，传递T细胞活化的第一信号。同时，NKG2D与配体结合会诱导NKG2D同源二聚体跨膜区域的带电氨基酸残基通过两个盐桥连接到DAP10的跨膜残基上，形成六聚体结构，继而诱导细胞质中YxxM基序的磷酸化，然后激活下游磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号通路，传递T细胞激活的第二信号。因此，构建基于NKG2D的CAR-T细胞，可以对多种肿瘤进行识别和杀伤，起到广谱抗肿瘤的作用。

IL-24是IL-10家族的一种多功能广谱的抑癌基因，它可以通过JAK/STAT途径、P38MAPK途径、PKR途径以及Fas/FasL途径以及内质网应激等多种途径促进肿瘤细胞凋亡，也可以抑制肿瘤局部新生血管形成进而抑制肿瘤生长。另外，有研究报道IL-24还可以增强放化疗敏感性以及抑制癌细胞侵袭和迁移等作用，而对正常细胞没有任何毒副作用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明利用shRNA基因沉默技术抑制PD-1蛋白在NKG2Dx24CAR-T细胞中的表达，设计出PD-1^KDNKG2Dx24 CAR(结构示意图如图1所示)，制备出PD-1^KDNKG2Dx24 CAR-T细胞，该CAR-T细胞由于不表达PD-1而避免受肿瘤微环境中PD-L1分子介导的免疫抑制，能够长效维持抗肿瘤活性。

本发明中，“shRNA”指short hairpin RNA，翻译为“短发夹RNA”，克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列。

本发明中，“NKG2D”是一种在人类天然杀伤细胞，CD56+和CD8+T细胞表面表达的激活性受体，“NKG2D基因”即表达NKG2D的核苷酸序列。

本发明中，“CD3ζ基因”为编码CD3ζ链的基因，CD3具有五种肽链，即γ链、δ链、ε链、ζ链和η链，这五种链均为跨膜蛋白，本发明主要涉及的为ζ链。

一方面，本发明提供了一种重组质粒。

所述的重组质粒中包括：