[发明专利]一种基因修饰的T细胞及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 202310074220.8 | 申请日： | 2023-01-19 |
| 公开（公告）号： | CN116004726A | 公开（公告）日： | 2023-04-25 |
| 发明（设计）人： | 吴金芸;叶华衍 | 申请（专利权）人： | 中海峡（福建）细胞生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/113;C12N15/62;C12N7/01;C12N5/10;A61K31/713;A61K35/17;A61K38/20;A61P35/00;C12R1/92 |
| 代理公司： | 北京精金石知识产权代理有限公司 11470 | 代理人： | 杨佩佩 |
| 地址： | 350000 福建省福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基因 修饰 细胞 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种重组质粒，其特征在于，包括：
(1)靶向沉默PD-1的shRNA序列；
(2)包括NKG2D基因、CD3ζ基因、IL-24基因、P2A剪切肽基因的串联序列。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的shRNA序列根据SEQ ID NO.1-3任一条siRNA设计得到。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述的shRNA序列选自以下任一：
(1)正义链SEQ ID NO.5，反义链SEQ ID NO.6；
(2)正义链SEQ ID NO.7，反义链SEQ ID NO.8；
(3)正义链SEQ ID NO.9，反义链SEQ ID NO.10。
4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的NKG2D基因与反向颠倒的CD3ζ基因拼接，再将IL-24基因与上述拼接基因通过P2A剪切肽基因序列串联。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的NKG2D基因为SEQ ID NO.13；所述的CD3ζ基因为SEQ ID NO.17；所述的IL-24基因为SEQ IDNO.19；所述的P2A剪切肽基因为SEQ ID NO.15。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述的串联序列为SEQ ID NO.21。
7.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的shRNA序列和串联序列分别位于不同的启动子下游。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的骨架为pLL3.7-U6-EF1a-EGFP质粒。
9.根据权利要求8所述的重组质粒，其特征在于，所述的shRNA序列位于U6启动子下游，所述的串联序列位于EF1a启动子下游。
10.根据权利要求9所述的重组质粒，其特征在于，所述的shRNA序列的插入酶切位点为HpaI和XhoI之间；所述的串联序列插入酶切位点为Nhe I和EcoR I之间。
11.根据权利要求10所述的重组质粒，其特征在于，序列为SEQ ID NO.25。
12.权利要求1-11任一项所述的重组质粒在制备慢病毒或T细胞中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的T细胞为CAR T细胞。
14.一种重组慢病毒，其特征在于，包括权利要求1-11任一项所述的重组质粒。
15.一种基因修饰的T细胞，其特征在于，共表达靶向PD-1的shRNA、IL-24和NKG2D CAR。
16.根据权利要求15所述的T细胞，其特征在于，通过权利要求14所述的重组慢病毒制备得到。
17.权利要求1-11任一项所述的重组质粒或权利要求14所述的重组慢病毒或权利要求15-16任一项所述的T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
18.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求1-11任一项所述的重组质粒或权利要求14所述的重组慢病毒或权利要求15-16任一项所述的T细胞。
19.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1-11任一项所述的shRNA序列和串联序列插入载体骨架。
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