[发明专利]一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：胃癌患者肿瘤组织样本的收集、全外显子组测序(WES)、RNA测序、序列的表位预测、新抗原预测、新抗原免疫原性的体外评估、流式细胞技术检测细胞因子的情况和IFN-γELISPOT测定。

2.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在新抗原免疫原性的体外评估步骤中，包括将冷冻的人PBMC解冻并在添加有10％FCS的AIM-V培养基中培养，在培养基中加入25ng mL^-1IL-7(PeproTech)在第2天加入20U ml^-1IL-2(PeproTech)，每3天更换一半含有细胞因子的培养基，将2×10⁵个PBMC接种在含有单个肽(25μg mL^-1)的96孔细胞培养板中并孵育过夜，使用无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作阴性和阳性对照，对于抗原特异性T细胞的体外刺激，刺激1天后，收集细胞用于进一步的免疫分析，检测细胞因子的变化。

3.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在流式细胞技术检测细胞因子的步骤中，包括根据流式多因子检测技术(CBA)产品说明书(BDBiosciences)在体外利用合成的突变多肽刺激后细胞上清液中的IFN-γ浓度，无肽培养基(PBS)和刺激性植物凝集素(PHA)分别用作空白(阴性)和阳性对照，将样品使用CytoFLEXLX流式细胞仪(Beckman Coulter)检测并分析数据，将合成的突变肽混合在一起刺激PBMC，对PBMC样品中的CD8+和IFN-γ的变化进行检测和分析。

4.根据权利要求1所述的一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法，其特征在于，在IFN-γELISPOT测定步骤中，对于体外预刺激的PBMC，在用载有相应多肽的经辐照的自体PBMC过夜刺激后，使用IFN-γELISPOT试剂盒(达科为)评估T细胞释放的IFN-γ的分泌，包括预刺激PBMC(每孔10⁵个细胞)和装载有相应肽(1-20μg mL^-1)的经辐照自体PBMC以一式三份添加到孔中，在AIM-V培养基中孵育18-20小时，洗涤后，加入稀释的检测抗体，37℃孵育1小时，然后将链霉亲和素-HRP(1:100稀释)和3-氨基-9-乙基咔唑溶液混合物依次加入每个孔中，在室温下将板在黑暗中保持约20分钟后，加入去离子水以终止反应，在ELISPOT读取器(Cellular Technology Inc)下扫板，并使用ELISPOT软件(AID)分析数据。

5.一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：连接肽的选择、PLGA纳米微球制备、纳米微球负载的蛋白的制备、SYNZIP1与如权利要求1所述的新抗原连接合成特异性多肽、ACTI新型纳米疫苗的制备、ACTI新型纳米疫苗的活性验证。

6.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接肽为SYNZIP1/SYNZIP2组合，所述SYNZIP1核酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述SYNZIP2核酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述SYNZIP2氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.根据权利要求5所述的一种用于胃癌治疗的新型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在PLGA纳米微球制备步骤中，包括以下步骤20mg SYNZIP2(sulfo-SMCC)交联活化反应、核酸分子CpG(CpG ODN1018)10mg与sulfo-SMCC交联反应、将CpG核酸分子和SYNZIP2接头偶联于PLGA纳米微球。