[发明专利]一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程和生物催化领域，具体公开了一种耐热α‑L‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用；所述α‑L‑鼠李糖苷酶为如（a）或（b）所述的蛋白质：（a）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有α‑L‑鼠李糖苷酶活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明提供了一种新型热稳定性较强且能高效切除芦丁α‑1,6鼠李糖苷键的α‑L‑鼠李糖苷酶，能够长时间耐受高温，热稳定性优异，对芦丁有较高的水解效率，摩尔转化率高达99.5%，并且公开了上述酶转化芦丁为异槲皮素的最佳反应条件。

技术领域

本发明属于基因工程和生物催化领域，具体公开了一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用。

背景技术

芦丁是一种常见的黄酮类化合物，具有抗氧化，抗高血糖和神经保护作用等多种生物活性。它广泛存在于植物中且含量较高，如银杏叶、槐米等，因此对其提取和分离相对容易，且成本较低。

异槲皮素，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，是一种稀有黄酮醇苷，具有广泛的药理活性，包括抗氧化作用、抗高血压作用、抗癌作用、抗流感活性和抗炎活性等。与芦丁相比：(1)异槲皮素对恶性肿瘤具有更强的抗增殖作用，对HIV-1和HSV-1/2的活性具有更好的抑制作用，在清除自由基对损伤细胞的保护作用也优于芦丁。因此，异槲皮素在抗癌、抗阿尔兹海默症、抗HIV等方面具有巨大的应用潜力。(2)连接单一的葡萄糖基能够提供合适的分子极性，有利于提高小肠上皮细胞对其吸收的效率。此外，异槲皮素还是生产酶改性(α-葡萄糖基化)异槲皮素(EMIQ)的关键合成中间体，EMIQ不仅着色效果好、天然无毒，而且水溶性较好，并具有广泛的生物活性，是目前唯一被美国FDA批准的黄酮类食品添加剂。尽管异槲皮素具有许多重要和特殊的生物活性，但其在自然界中的含量很低，难以从植物中进行大规模提取分离，导致生产成本高，这极大地限制了它们的大规模应用。因此，一种高效制备异槲皮素的方法对其广泛的应用具有重要意义。

异槲皮素的结构与芦丁仅相差一个L-鼠李糖基，通过有效的手段选择性地切除芦丁上的L-鼠李糖基将易于获得高附加值产物异槲皮素。酶法具有反应条件温和、专一性强、副产物少、环境污染小、易分离纯化等特点，已逐渐被应用于天然产物的改性增效。α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是一种可水解多种天然化合物中存在的非还原末端L-鼠李糖残基的一种糖苷水解酶，如柚皮苷、芦丁、淫羊藿苷、橘皮苷和萜苷等。虽然目前已有研究和相关专利中，报道了少部分微生物来源的a-L-鼠李糖苷酶能够水解芦丁生成异槲皮素，但是由于芦丁的溶解度受溶液的温度影响显著，20℃冷水中溶解度为0.012％，高温下芦丁溶解度极大提高。此外，酶在高温下的良好热稳定性对于工业应用是有利的，因为它可以降低底物粘度，增强底物溶解度，并降低微生物污染的风险。但大多数a-L-鼠李糖苷酶在较高温度的热稳定性不强，无法耐受高底物浓度转化体系所需的温度，这大大限制了它们的工业用途。因此发掘热稳定性较强的能够同时高效转化芦丁生成异槲皮素的α-L-鼠李糖苷酶非常重要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开了一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用。

本发明的技术方案如下：

一种耐热α-L-鼠李糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶为如(a)或(b)所述的蛋白质：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有α-L-鼠李糖苷酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

上述α-L-鼠李糖苷酶能够长时间耐受高温，热稳定性优异，对芦丁有较高的水解效率，摩尔转化率高达99.5％

进一步的，上述一种耐热α-L-鼠李糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示氨基酸序列相似度60％以上。