[发明专利]一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种耐热α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，所述α-L-鼠李糖苷酶为如（a）或（b）所述的蛋白质：

（a）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有α-L-鼠李糖苷酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种耐热α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于，所述α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示氨基酸序列相似度60%以上。

3.一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码如权利要求1所述的耐热α-L-鼠李糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的一种核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求3所述的核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组中整合有所述权利要求3所述的核苷酸或所述宿主细胞中含有如权利要求5所述的重组载体。

7.如权利要求1或2所述的耐热α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将编码所述耐热α-L-鼠李糖苷酶的DNA 片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，诱导表达并纯化目的蛋白。

8.根据权利要求7所述的耐热α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1以提取的 Thermoclostridium stercorarium DSM 2910基因组 DNA 为模板，根据大肠杆菌密码子偏好性对基因片段进行改造并合成得到SEQ ID No.2所示的DNA分子；

S2用具有 SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列的上游引物和具有 SEQ ID No:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR 扩增得到的 DNA 分子和 pET20b 分别用 NcoI和XhoI进行双酶切，连接得到含有所述的α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；

S3将步骤S2得到的重组质粒转化到表达大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，阳性转化子于37℃培养，加0.05 mM IPTG诱导基因表达，待产酶阶段结束离心收集菌体，然后用压力破碎仪破碎细胞，，离心取上清，然后通过Ni-TED 6FF纯化柱进行纯化，得所述耐热α-L-鼠李糖苷酶。

9.如权利要求1或2所述的耐热α-L-鼠李糖苷酶在转化芦丁制备异槲皮素等糖苷类天然产物改性增效方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：所述的α-L-鼠李糖苷酶在pH 5.0-8.0，温度50℃-75℃的条件下水解芦丁制备异槲皮素。