[发明专利]一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法。本发明的重组DNA疫苗通过将基因Ag85B、Rv2029c和Rv1738重组入真核表达载体获得。本发明研究发现，免疫6～8周龄C57BL/6雌性小鼠后，DNA疫苗Ag85B‑Rv2029c‑Rv1738‑pVAX1可以显著提高小鼠外周血中CD4⁺，CD8⁺T淋巴细胞的比例，增加小鼠脾淋巴细胞抗原特异性Th1型细胞因子IL‑2，IFN‑γ，TNF‑α的分泌，降低小鼠肺、脾的BCG细菌计数，提示该重组DNA疫苗可以有效控制分枝杆菌在小鼠体内的生长繁殖。因此，本发明的重组DNA疫苗可用于结核分枝杆菌感染的预防和治疗。

本申请是申请日为2020年09月29日、申请号为CN202011047690.8、发明名称为《一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法》的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程和重组DNA疫苗开发技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法。

背景技术

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种严重的呼吸道传染病。虽然多种类型的新型疫苗已被广泛研究，包括重组BCG疫苗、营养缺陷型结核分枝杆菌疫苗、蛋白质多肽疫苗、DNA疫苗、以病毒为载体的结核亚单位疫苗等，但现有疫苗或多或少存在缺陷，例如卡介苗(BCG)虽然可以有效预防粟粒型结核和结核性脑膜炎。但是其对成人保护效果有限，复种无效。且卡介苗为预防性疫苗，不能对潜伏感染的个体提供有效保护，因此，研制新型结核疫苗迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗及其制备方法，该疫苗可补充市售卡介苗性能，控制结核病潜伏感染，有望用于卡介苗初始免疫后的加强免疫用疫苗；控制潜伏感染的治疗性疫苗；与药物联用控制结核病的治疗性疫苗。

本发明中，选取标准株H37Rv中完整的Ag85B，Rv2029c和Rv1738，通过酶切连接于表达载体；其中，重组的Rv1738(285bp,1965657..1965941)，Rv2029c(1020bp,2275405..2276424)可以用于潜伏期结核病的血清学检测，Ag85B(978bp，2134897..2135874)可以用于急性感染期的血清学检测，因此这些基因都可以作为疫苗的候选基因，本发明将上述基因重组于载体pVAX1，作为DNA疫苗。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种结核分枝杆菌的重组DNA疫苗，其通过将基因Ag85B、Rv2029c和Rv1738重组入表达质粒获得。优选的，表达质粒为pVAX1，重组疫苗为Ag85B-Rv2029c-Rv1738-pVAX1(简称为B21)。

本发明进一步提供一种上述的结核分枝杆菌的重组DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)扩增Ag85B、Rv2029c和Rv1738基因；

(2)分别用双酶切Ag85B基因和表达质粒，胶回收连接获得重组质粒；

(3)将步骤(2)获得的重组质粒转化、扩增并表达；

(4)分别用双酶切步骤(3)获得的重组质粒和Rv2029c基因，胶回收连接形成重组质粒；

(5)将步骤(4)获得的重组质粒转化、扩增并表达；

(6)分别用双酶切步骤(5)获得的重组质粒和Rv1738基因，胶回收连接形成重组质粒；

(7)将步骤(6)获得的重组质粒转化、扩增并表达，即得到重组DNA疫苗。

优选的，步骤(2)中，表达质粒是pVAX1。

优选的，步骤(2)中，双酶切使用的酶是Nhe I和HindⅢ；步骤(4)中，双酶切使用的酶是HindⅢ和EcoRⅠ；步骤(6)中，双酶切使用的酶是EcoRⅠ和NotⅠ。