[发明专利]苹果组培苗转基因体系建立的方法

说明书

本发明公开了一种苹果组培苗转基因体系建立的方法，体系建立：获得组培苗；苹果组培苗的遗传转化技术以离体培养的再生体系建立为基础，利用组织培养的方法，通过农杆菌介导进行转化。利用转基因技术将目的基因导入苹果组培苗中，主要应用DNA重组，通过基因融合将外源基因插入到基因组中，经过组织培养获得苹果组培苗转基因植株，从而获得新品种。脱菌后获得抗性芽；再生植株进行PCR和RT‑PCR检测，选取阳性植株，重复操作3次，即完成。本发明可实现转基因苹果组培苗的快速培育，随着遗传转化技术的快速发展，植物通过被导入外源基因而获得本身不具有的优良性状。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种苹果组培苗转基因体系建立的方法。

背景技术

苹果组培苗的遗传转化技术以离体培养的再生体系建立为基础，利用组织培养的方法，通过农杆菌介导进行转化。利用转基因技术将目的基因导入苹果组培苗中，主要应用DNA重组，通过基因融合将外源基因插入到基因组中，经过组织培养获得苹果组培苗转基因植株，从而获得新品种。

在苹果组培苗上利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化的研究逐渐增加。采用叶盘法，将农杆菌与苹果组培苗绿袖叶片共转化获得转基因株系。

基因工程作为苹果组培苗遗传改良的重要方法，可以克服传统育种存在的诸多问题。随着遗传转化技术的快速发展，植物通过被导入外源基因而获得本身不具有的优良性状。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种苹果组培苗转基因体系建立的方法。

本发明的技术方案为：苹果组培苗转基因体系建立的方法，包括以下步骤：

(1)将继代培养3-4周的苹果组培苗上剪取形态学上端的第二、第三片幼嫩叶，在预培养MS培养基上进行过夜培养用于遗传转化；

(2)从LB固体培养基上挑取含有目的基因的农杆菌的单菌落，将其加到含有Spe和Rif的LB液体培养基中，28℃条件下、200rpm振荡过夜培养；之后将摇好的菌液加入含有Spe和Rif的LB液体培养基按照1∶4的比例充分混合，之后继续振荡培养至OD600为0.4-0.7之间；室温下5000rpm离心5min收集菌体，用液体培养基将菌液悬浮至OD600为0.5，每25mL的重悬菌液中需要加10μL的乙酰丁香酮；

(3)将经步骤(1)处理后的叶片取出，将叶片边缘剪去并均匀剪成0.3×0.5cm的小叶块，并在叶脉处横切3-4刀，将剪好的叶块放置在液体培养基中浸泡5min；然后将其放到步骤(2)得到的重悬菌液中用于侵染，轻晃菌液，每隔3min晃动一次，每次40S，浸泡时间为6min，然后用无菌滤纸吸干小叶块上的农杆菌菌液并快速移到共培养培养基中，叶背朝下放置，25℃条件下暗培养3-4天；

(4)暗培养结束后，将小叶块转入再生培养基上，叶背朝上放置，继续暗培养至出现愈伤组织和不定芽，之后转移到光下进行培养；当绿色不定芽逐渐长大之后，转入到继代培养基中进行培养；

(5)取步骤(4)继代培养得到的再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含目的基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH₂O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的苹果组培苗转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的苹果组培苗基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的苹果组培苗基因再生植株，即完成苹果组培苗转基因体系建立。

进一步地，所述预培养MS培养基组成为：4.43g/L MS+2mg/L TDZ+0.2mg/L IBA+

30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH值调至5.88。

进一步地，所述含有Spe和Rif的LB液体培养基组成为：4.43g/L MS+15g/L蔗糖+5g/L葡萄糖；且含有50mg/L的Spe和50mg/L的Rif。