[发明专利]苹果组培苗转基因体系建立的方法

权利要求书

1.苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将继代培养3-4周的苹果组培苗上剪取形态学上端的第二、第三片幼嫩叶，在预培养MS培养基上进行过夜培养用于遗传转化；

(2)从LB固体培养基上挑取含有目的基因的农杆菌的单菌落，将其加到含有Spe和Rif的LB液体培养基中，28℃条件下、200rpm振荡过夜培养；之后将摇好的菌液加入含有Spe和Rif的LB液体培养基按照1∶4的比例充分混合，之后继续振荡培养至OD600为0.4-0.7之间；室温下5000rpm离心5min收集菌体，用液体培养基将菌液悬浮至OD600为0.5，每25mL的重悬菌液中需要加10μL的乙酰丁香酮；

(3)将经步骤(1)处理后的叶片取出，将叶片边缘剪去并均匀剪成0.3×0.5cm的小叶块，并在叶脉处横切3-4刀，将剪好的叶块放置在液体培养基中浸泡5min；然后将其放到步骤(2)得到的重悬菌液中用于侵染，轻晃菌液，每隔3min晃动一次，每次40S，浸泡时间为6min，然后用无菌滤纸吸干小叶块上的农杆菌菌液并快速移到共培养培养基中，叶背朝下放置，25℃条件下暗培养3-4天；

(4)暗培养结束后，将小叶块转入再生培养基上，叶背朝上放置，继续暗培养至出现愈伤组织和不定芽，之后转移到光下进行培养；当绿色不定芽逐渐长大之后，转入到继代培养基中进行培养；

(5)取步骤(4)继代培养得到的再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含目的基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH₂O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的苹果组培苗转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的苹果组培苗基因再生植株的RNA，进行RT-PCR检测，选取阳性的苹果组培苗基因再生植株，即完成苹果组培苗转基因体系建立。

2.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，所述预培养MS培养基组成为：4.43g/L MS+2mg/L TDZ+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH值调至5.88。

3.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，所述含有Spe和Rif的LB液体培养基组成为：4.43g/L MS+15g/L蔗糖+5g/L葡萄糖；且含有50mg/L的Spe和50mg/L的Rif。

4.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，所述共培养培养基组成为：4.43g/L MS+2mg/L TDZ+0.2mg/L IBA+5g/L葡萄糖+0.5g/L水解酪蛋白+25g/L蔗糖+15g/L琼脂。

5.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，所述再生培养基组成为：4.43g/L MS+2mg/L TDZ+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH值调至5.88，且含有250mg/L的Cef和250mg/L的Tim。

6.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，所述继代培养基组成为：4.43g/L MS+30g/L蔗糖+0.05mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+7.5g/L琼脂，pH值调至5.88。

7.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述3-4周是指26天。

8.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过夜培养是指培养14小时。

9.根据权利要求1所述的苹果组培苗转基因体系建立的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述暗培养3-4天是指暗培养4天。