[发明专利]一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法

权利要求书

1.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，其特征在于，所述crRNA为crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su的组合；

所述crRNA-Me的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA-Ab的序列如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA-Su的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，其特征在于，所述crDNA为crDNA-Me、crDNA-Ab和crDNA-Su的组合；

所述crDNA-Me的序列如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA-Ab的序列如SEQ ID NO.5所示；所述crDNA-Su的序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的DNA，其特征在于，所述DNA为DNA-Me、DNA-Ab和DNA-Su的组合；

所述DNA-Me的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DNA-Ab的序列如SEQ ID NO.8所示；所述DNA-Su的序列如SEQ ID NO.9所示。

4.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA或权利要求2所述的crDNA。

5.如权利要求4所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；所述Cas蛋白为CRISPR-Cas13蛋白。

6.如权利要求5所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团；所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1；

进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。

7.一种利用权利要求4所述试剂盒以非诊断目的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)提取待测样本的基因组；

(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；

(3)取RPA扩增产物分别建立Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系，在37℃下，孵育5～30min；

(4)将Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系分别放入LED照射灯下，当Me检测体系荧光显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当Ab检测体系荧光显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当Su检测体系荧光显色时，表明待测样本是猪种布鲁氏杆菌菌株；当三个反应体系同时不形成荧光显示时，表明待测样本不存在牛、羊和猪种布鲁氏杆菌感染。

8.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。

9.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA扩增的引物序列为：

正向引物：

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCGTATGGTTCAGCCGCACAATTTCGGAA T-3'；

反向引物：5'-AACCGGTCATCTGGCAGGGGCAGGCCTTGG-3'；

所述RPA扩增体系为：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，总体积10μL；

扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。

10.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系相同，具体为：Tris-HCl 400mM、MgCl₂ 120mM、ssRNA荧光探针2μM、crRNA 0.5μL、RNase Inhibitor 0.5μL、Cas13a蛋白2μL、T7 Polymerase0.25μL、rNTP 0.4μL，RPA扩增产物1μL，总体积10μL。