[发明专利]一种外膜化心脏类器官制备方法及模型

权利要求书

1.一种外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在第一多孔板内对多能干细胞进行分化培养得到心血管前体细胞；

在多能干细胞融合度到达40％-60％后，去除培养基，加入第一预定量含有4μm CHIR的RPMI1640+B27培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间，这里将不含胰岛素的RPMI1640+B27培养基称为RB-培养基；

第一预定时间后吸弃上清，向所述第一多孔板的每孔加入第二预定量的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第二预定时间；

第二预定时间后吸弃上清，向每孔加入第三预定量含有4μmIWP-2的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间；

第一预定时间后吸弃上清，向每孔加入第三预定量的RB-培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间；

第一预定时间后吸弃上清，更换含有胰岛素的RPMI1640+B27培养基，放入培养箱中继续培养得到心外膜谱系细胞，这里将含有胰岛素的RPMI1640+B27的培养基记为RB+培养基；

对所述心外膜谱系细胞进行诱导分化；

对诱导分化后含有所述心外膜谱系细胞的心血管前体细胞进行培养。

2.根据权利要求1所述的外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，所述在第一多孔板内对多能干细胞进行分化培养得到心血管前体细胞的步骤，包括以下步骤：

将富集至80％-90％的多能干细胞消化成小团块，按1:(10-15)的比例传代培养，在第一多孔板内的E8完全培养基中加入5μmY27632培养第二预定时间；

第二预定时间后，更换新鲜的E8完全培养基，放入培养箱中在第一预定温度下培养第二预定时间。

3.根据权利要求1所述的外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，所述对所述心外膜谱系细胞进行诱导分化的步骤，包括以下步骤：

吸弃上清，用PBS清洗细胞一次，加入50％TRYPLE400μL消化细胞，放入培养箱中在第一预定温度下孵育第三预定时间；

第三预定时间后吸丢消化酶，加入第四预定量含10μm Y27632的RB+培养基，通过70μm网筛过滤细胞后，按1:8接种到预先用Matrigel胶包被的第二多孔板，放入培养箱中在第一预定温度下孵育第二预定时间；

第二预定时间后吸弃上清，在一个孔中加入第一预定量含有4μmCHIR的RB+培养基，另一个孔中加入第一预定量不含CHIR的RB+培养基作为对照，放入培养箱中在第一预定温度下培养第一预定时间。

4.根据权利要求3所述的外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，所述对诱导分化后含有所述心外膜谱系细胞的心血管前体细胞进行培养的步骤，包括以下步骤：

吸弃上清，用PBS清洗细胞一次，加入50％TRYPLE400μl消化细胞，放入培养箱中在第一预定温度下孵育第三预定时间；

第三预定时间后，吸丢消化酶，加入第四预定量含10μm Y27632的RB+培养基，通过70μm网筛过滤细胞；在第三多孔板的每个孔中加入第五预定量含10μm Y27632的RB+培养基，每孔中接入5000个细胞，放入培养箱中在第一预定温度下培养第二预定时间；

第二预定时间后，每孔加入60μl的RB+培养基，再加入10ng/ml bFGF和50ng/mlVEGFA，放入培养箱中在第一预定温度下培养第四预定时间；

第四预定时间后，每个孔吸丢40μl的培养基，剩余量按40μl计算，补充RB+培养基160μl，放入培养箱中在第一预定温度下培养，每3天更换含10ng/mlbFGF和10ng/ml VEGFA的RB+培养基。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，所述第一预定量为1.8ml-2.2ml，所述第二预定量为1.2ml-1.8ml，所述第三预定量为2.2ml-2.8ml。

6.根据权利要求4所述的外膜化心脏类器官制备方法，其特征在于，所述第四预定量为0.8ml-1.2ml，所述第五预定量为45μl-55μl。